Ici, une description détaillée du protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de profils de dispersion de relaxation de 15N par spectroscopie RMN en solution est fournie.
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Article de méthode
15 ans N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the μs-ms Timescale
Dans cet article
Résumé
Résumé
La dynamique conformationnelle des protéines joue un rôle fondamental dans la régulation de la catalyse enzymatique, de la liaison au ligand, de l’allostery et de la signalisation, qui sont des processus biologiques importants. Comprendre comment l’équilibre entre la structure et la dynamique régit la fonction biologique est une nouvelle frontière dans la biologie structurale moderne et a déclenché plusieurs développements techniques et méthodologiques. Parmi ceux-ci, les méthodes RMN de la solution de dispersion de relaxation CPMG fournissent des informations uniques de résolution atomique sur la structure, la cinétique et la thermodynamique des équilibres conformationnels des protéines se produisant sur l’échelle de temps μs-ms. Ici, l’étude présente des protocoles détaillés pour l’acquisition et l’analyse d’une expérience de dispersion de relaxation de 15N. À titre d’exemple, le pipeline pour l’analyse de la dynamique μs-ms dans le domaine C-terminal des bactéries enzyme I est montré.
Introduction
Les expériences de dispersion de relaxation (RD) de Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) sont utilisées sur une base de routine pour caractériser les équilibres conformationnels se produisant sur l’échelle de temps μs-ms par spectroscopie RMN en solution1,2,3,4,5. Comparativement à d’autres méthodes d’étude de la dynamique conformationnelle, les techniques cpmg sont relativement faciles à mettre en œuvre sur les spectromètres RMN modernes, ne nécessitent pas d’étapes spéci....
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Protocole
1. Préparation de l’échantillon RMN
- Exprimer et purifier un échantillon 2H,15N-labled de la protéine d’intérêt.
REMARQUE: Bien qu’un échantillon de protéines marqué 15N puisse être utilisé pour l’acquisition de l’expérience CPMG RD, la perdeutérisation (dans la mesure du possible) augmente considérablement la qualité des données obtenues. Des protocoles pour la production de protéines perdeutérérées sont disponibles dans la littérature13. - Le tampon échange l’échantillon de protéine purifiée dans un tampon RMN dégazé.
- Transférer l’échantillon RMN dans le tube RMN.
REMARQUE: La ....
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Résultats
Le protocole décrit ici entraîne l’acquisition de profils RD pour chaque pic du spectre TROSY 1H-15N (Figure 3A). A partir des profils RD acquis, il est possible d’estimer la contribution d’échange à la relaxation transversale de 15N de chaque groupe amide de la dorsale(figure 3A,3B). En traçant le Rex sur la structure 3D de la protéine à l’étude, il est possible d’identifier les régions structurelles .......
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Discussion
Ce manuscrit décrit le protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de données 15N RD sur les protéines. En particulier, les étapes cruciales pour la préparation de l’échantillon RMN, la mesure des données RMN et l’analyse des profils RD sont couvertes. Ci-dessous, certains aspects importants concernant l’acquisition et l’analyse des expériences de RD sont discutés. Cependant, pour une description plus approfondie de l’expérience et de l’analyse des données, une étude minutieuse de la .......
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Déclarations de divulgation
Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit. Nous ne déclarons aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des fonds du NIGMS R35GM133488 et du Roy J. Carver Charitable Trust à V.V.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cryosonde | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D Cryosonde | Améliorer la sensibilité |
| Oxyde de deutérium | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99,8 % pur, utilisé dans la préparation d’échantillons RMN et de cultures deutérées |
| Centrifugeuse manuelle | United Scientific supply | CENTFG1 | Utilisé pour éliminer les bulles d’air ou le liquide résiduel collé sur les parois du tube RMN. |
| Spectromètre RMN à haut champ | Bruker Bruker | Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition des données RMN |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modélisation des données RMN |
| Pipette pasteur RMN Corning | Incorporation | 7095D-NMR | Pipette pastuer en verre Pyrex pour transférer l’échantillon liquide dans un tube RMN |
| Tube RMN | Willmad Precision | 535-PP-7 | Tube cylindrique en verre 7'' à paroi mince de 5 mm |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | le traitement des données RMN |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analyse des données RMN |
| Tospin 3.2 (ou plus récent) | Bruker | Logiciel | d’acquisition |
Références
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11)....
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Réimpressions et autorisations
