15 15 N CPMG Релаксационная дисперсия для исследования конформационной динамики белка на шкале времени мкс-мс
Summary
Здесь приведено подробное описание реализованного в лаборатории протокола для сбора и анализа профилей релаксационной дисперсии 15Н методом ямР-спектроскопии раствора.
Abstract
Конформационная динамика белка играет фундаментальную роль в регуляции ферментативного катализа, связывания лигандов, аллостерии и сигнализации, которые являются важными биологическими процессами. Понимание того, как баланс между структурой и динамикой управляет биологической функцией, является новым рубежом в современной структурной биологии и привело к нескольким техническим и методологическим разработкам. Среди них методы ЯМР релаксационного дисперсионного раствора CPMG предоставляют уникальную информацию с атомным разрешением о структуре, кинетике и термодинамике конформационных равновесий белка, возникающих на шкале мкс-мс времени. Здесь в исследовании представлены подробные протоколы для получения и анализа эксперимента по дисперсии релаксации 15Н. В качестве примера показан конвейер для анализа динамики мкс-мс в С-концевом домене бактерий Enzyme I.
Introduction
Эксперименты Карра-Перселла Мейбума-Гилла (CPMG) по релаксационной дисперсии (RD) используются на рутинной основе для характеристики конформационных равновесий, возникающих на временной шкале μs-ms с помощью растворной ЯМР-спектроскопии1,2,3,4,5. По сравнению с другими методами исследования конформационной динамики, методы CPMG относительно просты в реализации на современных ЯМР-спектрометрах, не требуют специализированных этапов подготовки образцов (т.е. кристаллизации, замораживания или выравнивания образцов и/или ковалентного сопряжения с флуоресцентной или парамагнитной меткой) и обеспечивают всестороннюю характеристику конформационных эквивалентов, возвращающих структурную, кинетическую и термодинамическую информацию о процессах обмена. Для того, чтобы эксперимент CPMG сообщал о конформационном равновесии, должны применяться два условия: (i) наблюдаемые спины ЯМР должны обладать различными химическими сдвигами в состояниях, подвергающихся конформационному обмену (микросостояниях) и (ii) обмен должен происходить в масштабе времени от ~ 50 мкс до ~ 10 мс. В этих условиях наблюдаемая поперечная скорость релаксации ( 
) представляет величину внутреннегоR2 (R2, измеренного при отсутствии динамики мкс-мс) и обменного вклада в 
поперечную релаксацию (Rex). Вклад Rex в R2obs можетбытьпостепенно гаситься путем уменьшения расстояния между импульсами 180°, составляющими блок CPMG последовательности импульсов, а результирующие кривые RD могут быть смоделировано с использованием теории Блоха-Макконнелла для получения разницы химических сдвигов между микросостояниями, дробной популяции каждого микросостояния и скоростей обмена между микросостояниями(Рисунок 1)1,2,3.
Несколько различных последовательностей импульсов и протоколов анализа были описаны в литературе для экспериментов с 15N CPMG. При этом описан протокол, реализованный в лаборатории. В частности, будут представлены важнейшие этапы подготовки образца ЯМР, настройки и получения ЯМР-экспериментов, а также обработки и анализа данных ЯМР(рисунок 2). Чтобы облегчить передачу протокола в другие лаборатории, импульсная программа, сценарии обработки и анализа, а также один пример набора данных предоставляются в виде дополнительных файлов и доступны для загрузки по адресу (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Предоставленная импульсная последовательность включает в себя четырехступенчатый фазовый цикл в блоке CPMG для подавления смещенно-зависимых артефактов6 и кодируется для получения нескольких чередующихся экспериментов. Эти чередующиеся эксперименты имеют идентичный период релаксации, но разное количество перефокусировки импульсов для достижения различных полей CPMG7. Также важно отметить, что описанная импульсная программа измеряет 15N R2 компонента TROSY ЯМР-сигнала8. В целом, протокол успешно применяется для характеристики конформационного обмена в белках среднего и крупного размера4,5,9,10. Для небольших систем (<20 кДа) целесообразно использовать гетероядерную последовательность импульсов11, 12наоснове гетеронуклеарной одноквантуковой когерентности (HSQC).
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной рукописи описан реализованный в лаборатории протокол для сбора и анализа 15N RD данных о белках. В частности, рассматриваются важнейшие этапы подготовки образца ЯМР, измерения данных ЯМР и анализа профилей РД. Ниже обсуждаются некоторые важные аспекты, касающиеся приобрет?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана средствами NIGMS R35GM133488 и благотворительного фонда Роя Дж.
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
References
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast’ NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
