Summary
我々は、下流の分子分析に使用するために、ヒトアストロサイト集団を新鮮凍結組織から濃縮し、単離する方法を開発しました。
Abstract
ヒトアストロサイトの複雑さは、一次ヒト組織において十分に定義されていないままであり、それらの単離および分子特性評価のためのより良いツールを必要とする。蛍光活性化核ソーティング(FANS)は、凍結アーカイブ組織からヒトニューロン核(NeuN+)集団を首尾よく単離および研究するために使用され、それによって新鮮な組織の取り扱いに関連する問題を回避できる。しかし、同様にアストログリアを非ニューロン(NeuN-)元素から単離する努力は欠けている。最近開発され、検証された免疫タグ付け戦略は、3つの転写因子抗体を使用して、非罹患、新鮮(非固定)スナップ凍結死後ヒト側頭新皮質組織から、富化ニューロン(NeuN+)、アストロサイト(ペアボックスタンパク質6(PAX6)+NeuN-)、および希突起膠細胞前駆細胞前駆細胞(OLIG2+NeuN-)核集団を同時に単離する。
この技術は、原発性病理学的てんかん新皮質における細胞型特異的トランスクリプトーム変化の特性評価に有用であることが示された。トランスクリプトーム解析により、PAX6+NeuN-選別集団は汎アストロサイトマーカーに対してロバストに濃縮され、安静状態と反応性条件の両方でアストロサイトを捕捉することが確認された。この論文では、単一核(sn)懸濁液への組織解離を含む、新鮮な凍結ヒト皮質からアストロサイト富化核集団を単離するためのFANS方法論について説明します。抗NeuNおよび抗PAX6蛍光結合抗体による核の免疫タグ付け;FANSゲーティング戦略と品質管理メトリックは、選別中の感度と特異度を最適化し、アストロサイト濃縮を確認するためのものです。下流のトランスクリプトームおよびクロマチンアクセシビリティシーケンシング(バルクまたはsn分解能)の調達を推奨します。このプロトコルは、さまざまな病状および24時間以内に推奨される死後組織収集を伴う非壊死性、新鮮凍結、ヒト皮質標本に適用可能である。
Introduction
ヒトアストロサイトの分子的複雑さは、一次組織において依然として十分に定義されておらず、健康と疾患の両方において、高解像度での単離および特性評価のためのより良いツールを必要とする。新鮮な脳組織サンプルの限られたアクセス、グリアおよびニューロンプロセスの高度に相互接続された性質、および処理中の不可避の細胞活性化のために、無傷のヒトニューロンおよびグリアをそれらのニッチから分離することは困難であることが証明されており、これらはすべてex vivoでのこれらの細胞型の分子特性評価を制限する1.蛍光活性化核ソーティング(FANS)は、生細胞ソーティングの代替として登場し、凍結組織からの核集団の解離および免疫タグ付けを可能にしている。過去10年間で、FANSは、さまざまな脳標本および解剖学的領域におけるヒトニューロン(NeuN+)核集団を単離し、分子的に特徴付けるために広く使用されるようになった1,2,3,4。
しかしながら、ヒト皮質から特異的グリア核亜集団を単離するための同様の方法は限られており、正常組織と罹患組織の両方におけるアストロサイトの複雑さの理解において、比較的洗練されていない。この目的のために、以前に公開されたプロトコルがFANS4を使用してヒトニューロン集団を単離するために適合され、トリプル抗体の組み合わせを使用してアストロサイト(および希突起膠突起前駆細胞)について濃縮する方法が検証され、安静時および反応性条件の両方でアストロサイトを捕捉する5。NeuN−画分中のアストロサイトについて特異的に富化するために、アストロサイト集団全体で差次的に発現されることが知られている2つの転写因子のうちの1つ、PAX6またはSRY−box転写因子9(SOX9)6、7に対する抗体を使用した。PAX6は、胚帯の橈骨グリア様前駆細胞内で胎児の早期発育中に高発現し、神経新生および神経膠形成の両方に寄与する8、9、10、11ならびに網膜ニューロン仕様12に寄与する。成人において、PAX6は、安静時ヒトアストロサイト6において差次的に過剰発現し、ヒトてんかん組織アストロサイト13においてグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)とのタンパク質共発現を示す。
このプロトコルは、FANSによる新皮質ニューロンおよびアストロサイト富化核集団の同時単離を記載している。成体皮質から収集された新鮮な(固定されていない)スナップ凍結(すなわち、新鮮な凍結)死後組織は、最初に機械的および化学的に解離される。スクロース勾配での溶解および超遠心分離の後、細胞質および細胞外成分は、核が保持されている間に廃棄される。次いで、核を所望の標的系統に対応する蛍光結合核抗体で標識し、FANSを用いて選別する。このアプローチに続いて、アストロサイトの濃縮が、標的 qPCR パネルと下流核 RNA シーケンシングの両方によって検証された、収集された PAX6+NeuN- 集団において実証されます。
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Protocol
注:マウントシナイのアイカーン医科大学(ISMMS)とその治験審査委員会(IRB)のヒト被験者保護プログラムは、研究の倫理的行為と連邦、州、および機関の規制の遵守を保証します。本研究では、使用したすべての死後検体を匿名化し、バイオリポジトリを通じて適切な同意を得て、ISMMSのIRB(HS#14-01007)による「ヒト研究」指定から免除された。
1. バッファー調製
注: ダウンストリーム RNA シーケンシングを実行する場合は、すべてのワークスペースとツールを RNase 除染ソリューションで徹底的に処理し、mRNA の分解を防止してください。
- 溶解バッファーを準備します。
- 5.47 gのスクロース(0.32 M最終)、250 μLの1 M CaCl 2(5 mM最終)、1 M Mg(CH3 COO)2(3mM最終)、10 μLの500 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)(0.1 mM最終)、500 μLの1 M Tris-HCl(pH 8)(10 mM最終)、 50 μL の Triton X-100 (0.1% 最終)、および 17 μL の 3 M ジチオスレイトール (DTT、1 mM 最終、新鮮に添加) (材料表を参照)。
- スクロース緩衝液を調製する
- 以下を50 mLまでの蒸留H2Oに溶解する:30.78 gのスクロース(1.8 M最終)、150 μLの1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM最終)、500 μLの1 M Tris-HCl(pH 8)(10 mM最終)、17 μLの3 M DTT(1 mM最終、新鮮に添加)。
2. 凍結組織が単核懸濁液に解離する
- 4 mLの氷冷溶解バッファーを7 mLのガラス組織ドウンサー(グラインダー)に加え、氷の上にとどまります。約200〜400mgの新鮮凍結ヒト成人皮質を解剖し、約50倍跳ね返り、組織ホモジネートを12mL超遠心ポリプロピレンチューブに移す。
- 5 mL ピペットを使用して、6.5 mL の氷冷スクロース緩衝液を超遠心管の底に加え、スクロースと組織ホモジネートの間の層を乱さないように注意します。
メモ: 追加のサンプルを処理する場合は、軽いサンプルに溶解バッファーを追加して、チューブの重量を慎重にバランスを取ってください。超遠心チューブの正確なバランスは、ローターの損傷を防ぎ、適切な速度での回転を確保するために不可欠です。
3. 超遠心分離
- 溶解液を24,400rpm(101,814× g)で4°Cで1時間超遠心分離する。 ペレットを乱すことなく、上清と破片を慎重に吸引します。
注:ペレットは、200mg未満の組織から始めると見えないことがあります。 - 600 μL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (Ca2+, Mg2+ フリー) を核ペレットに加え、氷上で 10 分間インキュベートしてから蘇生します。
- ピペットを50回上下させ、核ペレットを氷上に再懸濁させた。
- 血球計数器を使用して、顕微鏡下で無傷の核を視覚化し、次のステップに進む前に、再懸濁の濃度が105 核/ mLを超えていることを確認する(再懸濁核の10 μLと10 μLのトリパンブルーを組み合わせる)。
4. 抗体インキュベーション
- FANS用のサンプルにイムノタグを付けるには、再懸濁サンプルペレット500 μL、1x PBS(Ca2+、Mg2+フリー)490 μL、10%BSA(最終0.1%)10 μL、AF555にコンジュゲートしたマウス抗NeuN抗体1 μL(NeuN-AF555、最終濃度1:1000)、およびアロフィコシアニンにコンジュゲートしたマウス抗PAX6抗体(PAX6-APC、最終濃度1:1000)を加えます。
注:他の蛍光色素にコンジュゲートした代替抗体を追加することもできます(説明を参照)。ここでは、AF488にコンジュゲートしたマウス抗OLIG2(1:1000濃度)を良好な結果で使用した。 - 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)のみおよび単色コントロールを実行して、必要に応じて少量のサンプルを使用してゲーティングパラメータを設定します。
- AF555単色対照を行うには、再懸濁サンプルペレット20 μL、1x PBS(Ca2+、Mg2+フリー)970 μL、10% BSA(最終0.1%)10 μL、およびNeuN-AF555抗体1 μL(1:1000濃度)を加えます。
- APC単色対照を行うには、再懸濁サンプルペレット20 μL、1X PBS(Ca2+、Mg2+フリー)970 μL、10%BSA(最終0.1%)、およびPAX6-APC抗体1 μL(1:1000濃度)を加えます。
- DAPIのみのコントロールを行うには、再懸濁サンプルペレット20 μL、1X PBS(Ca2+、Mg2+フリー)970 μL、および10%BSA(最終0.1%)10 μLを追加します(DAPIは後で追加されます、4.4を参照)。
注:3つ以上の抗体を使用する場合は、単色コントロールに加えて、蛍光マイナス1(FMO)コントロールを実行することをお勧めします。
- サンプルとコントロールを暗所で回転させて4°Cで1時間インキュベートします。
- DAPI を 1:1000 にすべてのサンプルとコントロールに追加し、並べ替えを続行します。
5. 蛍光活性化核選別(ファン)
注:フローサイトメトリー/ソーティング技術にすでに堪能でない限り、訓練を受けた人員の支援を受けて、機関式のフローサイトメトリー施設を使用することをお勧めします。
- ゲートは下図通りです。
- まず、各サンプルについて、ゲートバイフォワードスキャッタ(FSC-A) 対。側方散乱(SSC−A)は、核に適切なサイズ範囲の粒子を含み、したがって赤血球および破片を除外する(図1A)。
注:非常にクリーンな原子核調製物は、より小さな破片クラスターと核クラスターを区別することができます。 - 次に、各サンプルについて、一重項核のみを含むようにFSC-A対FSC-W(またはFSC-A対FSC-H)およびSSC-A対SSC-W(またはSSC-A対SSC-H)によるゲート(図1B)。
- 次に、各サンプルについて、デブリ(DAPI−低、ゲート付き集団の左側)およびダブレット(ゲート付き集団の右側)を除く無傷の核一重項(DAPI−高ゲート集団)を含むようにDAPIによるゲート(図1C)。
- 蛍光対照に基づいてさらにゲーティングを設定し、FACSプロット上の別個のクラスターとして視覚的に決定する。
- DAPIのみのコントロールを実行して、抗体の非存在下での集団のバックグラウンド染色を決定した(図1D および 図2A)。
- NeuN-AF555のみのコントロールを実行して、AF555のチャンネルにおけるNeuN+染色のカットオフを決定します(図2B)。
- PAX6-APCのみのコントロールを実行して、APCチャンネルでのPAX6+染色のカットオフを決定します(図2C)。
- より多くの抗体を使用する場合は、追加の単色コントロールを実行します(図2D、E)。
注:3つ以上の抗体を使用する場合は、FMOコントロールを使用して集団の変化を視覚化することをお勧めします。
- すべてのコントロールを実行したら、NeuN+ コレクションと PAX6+ コレクションのゲートを、設定されたしきい値より上に描画します。
- NeuN+集団をゲートしてニューロンを収集します(図1E および 図2F)。
- NeuN-集団からPAX6+集団をゲートしてアストロサイトを採取する(図1E、F および 図2F)。
- NeuN-PAX6-集団から追加のグリア集団(OLIG2+によってここに示すように希突起膠細胞前駆細胞など)をゲートして収集する(図1F)。
メモ: 集団が不明瞭なためにフローサイトメトリーソフトウェアで適切なゲートカットオフを決定することが困難な場合は、視覚化するイベントの数を変更すると役立つ場合があります(FANSプロット上のイベント数を増減します)。
- まず、各サンプルについて、ゲートバイフォワードスキャッタ(FSC-A) 対。側方散乱(SSC−A)は、核に適切なサイズ範囲の粒子を含み、したがって赤血球および破片を除外する(図1A)。
- 意図した下流分析に基づいてサンプルを適切に収集します。
6. 下流分子分析のためのFANS集団の収集
- バルクRNAシーケンシングについては、PBSで50,000~500,000個の核を収集します(セクション7.1も参照)。
- 2 mLのスクロース溶液、50 μLの1 M CaCl 2、および30 μLの1 M Mg(CH3COO)2を加え、10 mLまでのPBSで満たします。
- 氷上で15分間転倒してインキュベートし、次いで900× g で4°Cで10〜15分間遠心分離する。
- 上清を吸引し、1 mLのRNA抽出試薬に再懸濁し、ボルテックス、ドライアイス上で凍結し、-80°Cで保存した。
- あるいは、サンプルを200 μLのRNA抽出試薬に直接集めます。選別後にRNA抽出試薬を1mLまで添加し、選別した試料に対する試薬の比率を1:1に維持する。ボルテックスは、ドライアイス上で凍結し、-80°Cで保存した。
- シーケンシング(ATAC-seq)を使用したトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのバルクアッセイでは、5%ウシ血清アルブミン(BSA)でコーティングした微量遠心チューブでPBS中の50,000~75,000核を収集します。核をドライアイス/-80 °C で凍結するか、直ちに ATAC 調製に使用してください。
- sn RNA-seqまたはATAC-seqの場合は、PBS中の0.04%BSA中の核を収集します(セクション7.2も参照してください)。
7. ライブラリ準備のヒント
- バルク核RNAシーケンシングライブラリの準備
- RNA抽出試薬で回収後、フェノール/クロロホルムを加えてエタノールで上水層からRNAを析出させ、続いてチューブ上でDNase消化(15分)することにより、標準的なフェノール/クロロホルムRNA抽出を行う。
- RNAクリーンアップを行い、最終容量の15μLの水で濃縮します。
注:この方法を使用すると、成体皮質サンプル300mgからの代表的な回収率は、約300,000 NeuN+核(クリーンアップおよび濃縮後に15-20ng/μLの総RNA)および~250,000個のPAX6+核(クリーンアップおよび濃縮後に10-12ng/μLの総RNA)である。この代表的な収率は、サンプル品質、ゲーティングストリンジェンシー、およびRNA回収率に基づいて大きく異なる可能性があります。 - シーケンシングの前に定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を行い、正準アストロサイトマーカー(GFAP、SOX9)、10-ホルミルテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ(ALDH1L1))の高微分発現、およびニューロンおよび他の細胞系譜マーカーの枯渇に基づいてアストロサイトの濃縮を確認した(図1G)。
注:ダブルネガティブ集団(NeuN-PAX6-)の収集により、アストロサイトの相対的濃縮について、より正確で多層なqPCR品質管理分析が可能になります(図2H)。 - 死後サンプルから期待されるように、低いRNA完全性数値に推奨されるキットを使用してRNA-seqライブラリを生成します。
- 単一核シーケンシングライブラリの準備
- 機関のシーケンシングコアを介してsnシーケンシングを実行します。
- ナノフルイディクスベースの処理およびシーケンシングでは、単一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)の場合は少なくとも60 μLの1 × 106 cells/mL + 0.04% BSAを、シーケンシング(snATAC-seq)を使用したトランスポザーゼアクセシブルクロマチンの単一核アッセイでは少なくとも20 μLの1x PBS + 0.04% BSAに×3~106 cells/mLの推奨濃度を使用します。
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Representative Results
核は、新鮮な(固定されていない)スナップ凍結側頭新皮質組織から、死後収集時間12時間で採取した。核懸濁液への組織解離後、サンプルをNeuN、PAX6、およびOLIG2に対する抗体と共にインキュベートし、図1および図2に示すゲーティングに従ってソートした。原子核は、NeuN+、PAX6+NeuN-、およびOLIG2+NeuN-選別された集団から収集された(図1E、Fおよび図2F)。標的 qPCR パネルでは、PAX6+(NeuN-) 集団における汎アストロサイトマーカー GFAP および ALDH1L1 の濃縮が明らかになりました (図 1G および図 2H)。さらに、OLIG2+集団は希突起膠細胞前駆細胞(OPC)マーカーPDGFRAについて濃縮された(図1G)。収集された集団のバルクRNAシーケンシングは、PAX6+(NeuN-)集団におけるアストロサイトマーカーの濃縮およびニューロンマーカーの枯渇を比較した(図1H)。免疫蛍光は、成人ヒト皮質アストロサイトにおけるPAX6とGFAPの共局在を確認した(図1I)。
単色コントロールを調べると、マーカーごとに正と負の母集団が区別され、収集のための正確なカットオフを設定することができました(図2A-G)。さらに、アストロサイト富化FANS単離を、アストロサイト核マーカーに対する2つの異なる抗体、SOX9およびPAX6と比較した。アストロサイト富化ゲート内では、PAX6を使用したFANS(~13.8%)よりも、SOX9を使用したFANS(~6%)よりも高い割合の核イベントが捕捉されました(図2F、G)。標的 qPCR パネルでは、SOX9+(NeuN-)およびPAX6+(NeuN-)の両方の集団におけるGFAPおよびPAX6、およびSOX9の濃縮が明らかになりました(図2H)。組織採取の死後間隔(PMI)を変化させたいくつかのサンプルの解離および染色を遡及的に比較したところ、より短いPMIがより大きな無傷の核回収と関連していることが明らかになった(図3A)。最大24時間のPMIを有する凍結組織は、最大90%の無傷の核の高い率を生じた。しかし、30時間PMIでは、無傷の原子核はほとんど回収できなかった(図3A)。標準プロトコルに抗体洗浄ステップを含めること(通常は回収を最適化するためにこのステップを省略する)は、別個のNeuN+/-またはPAX6+/-集団の分離における有意な変化を明らかにしなかった(図3B)。
時折、PAX6+NeuN-集団の分離不良が、生存可能な核の割合が高いサンプルでも見られず(図3C)、組織解離とFANSプロトコルの繰り返しが必要になった。単核RNA-seq研究はさらに、新皮質だけでなく、脳室下帯(SVZ)および隣接する線条体においても、原形質および線維性成体アストロサイト亜集団の両方にわたって 、PAX6 をトップに発現差のある核転写因子として優先した(図3D)。同じ脳サンプルに由来する新皮質と線条体との間のNEUN/PAX6/OLIG2トリプルファンの比較は、PAX6+核の分離における領域特異的な違いを示した(図3E)。このプロトコルは現在、新皮質についてのみ検証されています。
図1:FANSによるニューロンおよびアストロサイト富化単離の検証(A-F)デブリおよびダブレットを除外し、(D)(E-F)富化ニューロン(NeuN+)、アストロサイト(PAX6+NeuN-)、およびOPC(OLIG2++NeuN-)の核集団の収集のためのDAPIのみのコントロールを使用してバックグラウンド染色を定義するシーケンシャルFANSゲーティングの代表例。(g)収集された集団の品質管理のための汎アストロサイト(GFAP、ALDH1L1)、ニューロン(RBFOX3)、およびOPC(PDGFRA)マーカーを用いた最小qPCRパネル(A−G:病理学のない側頭新皮質剖検標本、12時間PMI、100,000イベントを示す;点線は陽性ゲートされた順次集団を表し、実線は細胞型富化集団の最終集合を表す)。(H)PAX6+およびNeuN+ソート集団(n = 3剖検症例、病理のない側頭新皮質、PMI 12-21時間)における正準アストロサイトおよびニューロンマーカーの発現を示す行正規化バルクRNAシーケンシングデータから生成されたヒートマップ。(i)ヒト新皮質におけるPAX6、GFAP、およびNeuNの代表的な免疫蛍光画像。矢印は、PAX6とGFAPを共発現するアストロサイトを示す。略語: FANS = 蛍光活性化核ソーティング;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;NeuN = ニューロン核;PAX6=対をなす箱型タンパク質6;OLIG2=希突起膠細胞転写因子2;OPC = 希突起膠細胞前駆細胞;qPCR = 定量的ポリメラーゼ連鎖反応;GFAP = グリア線維性酸性タンパク質 ;ALDH1L1=10-ホルミルテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ;RBFOX3=RNA結合タンパク質FOX-1ホモログ3;PDGFRA = 血小板由来成長因子アルファ;PMI = 死後間隔;SSC-A = 側面散乱面積;FSC-A = 前方散乱領域;SSC-W = 側面散乱幅;FSC-W = 前方散乱幅;NeuN-555 = AF555に共役したマウス抗NeuN;PAX6-APC=アロフィコシアニンにコンジュゲートしたマウス抗PAX6;OLIG2-488=488nmレーザーラインの緑色蛍光色素にコンジュゲートしたマウス抗OLIG2。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PAX6またはSOX9抗体を用いたアストロサイト富化集団の比較単離(A-E)DAPI、NeuN、PAX6、SOX9、およびOLIG2の単色対照は、それぞれの蛍光チャネルにおける陽性/陰性のカットオフを定義する。(F-G)(F)NeuN/PAX6抗体または(G)NeuN/SOX9抗体を用いたアストロサイト富化単離のための比較FANS法。アストロサイト富化ゲート内のSOX9よりもPAX6によって捕捉される事象の割合が大きい。(A-G:すべての実験に使用した同一の死後非病理学的側頭新皮質標本;12時間PMI;10,000イベントを示す)。(H) 品質管理qPCR解析により、F-GからPAX6+(NeuN-)およびSOX9+(NeuN-)選別された集団におけるアストロサイトマーカーの富化および非アストロサイトマーカーの枯渇が確認された(データはACTBに正規化され、NeuN+集団の倍数変化として定量化された)。略語:DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;NeuN = ニューロン核;PAX6=対をなす箱型タンパク質6;OLIG2=希突起膠細胞転写因子2;SOX9 = SRYボックス転写因子9;qPCR = 定量的ポリメラーゼ連鎖反応;GFAP = グリア線維性酸性タンパク質 ;RBFOX3=RNA結合タンパク質FOX-1ホモログ3;PDGFRA = 血小板由来成長因子アルファ;PMI = 死後間隔;NeuN-555 = AF555に共役したマウス抗NeuN;PAX6-APC=アロフィコシアニンにコンジュゲートしたマウス抗PAX6;OLIG2-488=488nmレーザーラインの緑色蛍光色素にコンジュゲートしたマウス抗OLIG2。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:FANS実験の成功に対する依存的および独立した測定基準 。 (A)サンプル採取PMIが核の質に及ぼす影響:PMIが低いほど、より多くの無傷の核の回収が可能になり、最大24時間で適切な結果が得られます。 (B)抗体インキュベーション後の洗浄ステップを含めることは、視覚的にFANS集団をシフトさせるようには見えません。(C)無傷の核の存在と低いバックグラウンド(左)にもかかわらず、明確なPAX6+(NeuN-)集団の欠如(右側)(死後側頭新皮質、非病理学的、7時間PMI)を伴う失敗したFANS実験の例。(D)他の細胞型と比較して、皮質およびSVZの両方の原形質および線維性アストロサイト亜集団にわたって、 PAX6 および他の2つのアストロサイト核因子 SOX9 および LHX2の差次的発現を示す成人ヒトsn RNA-seqデータのヒートマップ表現(赤色の勾配は対数正規化された平均遺伝子発現値のスペクトルを表す;n = 3つの異なる剖検症例、43,619総核。(E)明確な脳領域(側頭新皮質 対.SVZおよび亜瞳線条体)は、NeuN/PAX6/OLIG2分離の異なるパターンを示す。略語: FANS = 蛍光活性化核ソーティング;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;NeuN = ニューロン核;PAX6=対をなす箱型タンパク質6;OLIG2=希突起膠細胞転写因子2;GFAP = グリア線維性酸性タンパク質 ;ALDH1L1=10-ホルミルテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ;LXH2 = LIMホメオボックス2;PMI = 死後間隔;SSC-A = 側面散乱面積;FSC-A = 前方散乱領域;NeuN-555 = AF555に共役したマウス抗NeuN;PAX6-APC=アロフィコシアニンにコンジュゲートしたマウス抗PAX6;OLIG2-488 = 488nmレーザーラインの緑色蛍光色素にコンジュゲートしたマウス抗OLIG2;SVZ = 心室下帯;A(p) = 原形質(灰白質)アストロサイト;A(f) = 線維性(白質)アストロサイト;OL = 希突起膠細胞;OPC = 希突起膠細胞前駆細胞;EN = 興奮性ニューロン;MSN = 中程度の棘状ニューロン;MG = ミクログリア;BVC = 血管細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
概説されたプロトコルに従った実験計画は、いくつかの生物学的および技術的要因を考慮した後に完成されるべきである。出発組織サンプルは、新鮮・凍結され、固定されていることなく、好ましくは核回収を最大化するために短い死後収集間隔を有する。経験に基づいて、最大24時間のPMIは適切な核回復を可能にする。ただし、無傷の核回収を最適化するには、12時間以下のPMIが好ましい。PMI以外の追加の要因(体内貯蔵の温度や組織のpHレベルなど)も核収量に影響を与える可能性があるが、これらの研究では考慮されなかった14。逸話的な経験から、FANSの回収は、細胞型特異的発現に対する保存の変動性を評価するための対照実験は行われなかったが、-80°Cで最大5年間保存される同じ組織と同等であることが見出された。抗体インキュベーション後のサンプルの洗浄は、考慮が必要な別の変数です。一般に、洗浄ステップは全体的な収率を低下させるが、別個の免疫標識集団の分離を改善し得る。これらの研究では、抗体洗浄後のステップを含む場合または除外する場合、NEUN/PAX6集団の分離に差は認められなかったが、他の一次抗体および二次抗体を使用する場合、特にそれらがプレコンジュゲートされていない場合、このステップは有益であり得る。
選別装置の感度のばらつきにより、各選別イベントで適切な制御を行う必要があります。血球計数器で可視化する際に再懸濁サンプルに過剰な細胞外破片が見つかった場合、サンプルを40μmフィルターに通して核のみを保持することができます。サンプルが限られている場合は、適切な蛍光色素でタグ付けされたビーズを単色およびFMOコントロールに使用することもできます。qPCR またはシーケンシング結果のいずれかによって決定されるように、サンプルが目的のアストロサイト集団について濃縮されていないように見える場合は、すべての NeuN- および PAX6+(NeuN-) 集団をより厳密にゲートし、陽性集団と陰性集団のゲートカットオフの間により多くのスペースを残すことが役立つ場合があります。
ここに記載されている検証研究のほとんどは、ニューロン、アストロサイト、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)核集団を同時に濃縮するために、NeuNおよびPAX6に加えてOLIG2を使用して実施された。皮質アストロサイトをNeuN-フラクション内でより効果的に濃縮するために、第3の系統マーカーとしてOLIG2を含めることが推奨される。FITC結合OLIG2の有無は、PAX6+集団をシフトさせるようには見えない。したがって、OLIG2を除いた実験でも同様のアストロサイト濃縮が得られるという仮定がある。注目すべきは、一部のニューロン集団がNeuNとPAX615の両方を発現するため、PAX6+集団をNeuN-集団からゲートすることが不可欠である。アストロサイトはまた、SOX9発現に従ってソートすることができる。しかし、SOX9による染色および選別は、PAX6と比較してアストロサイトの濃縮の堅牢性を低下させる。成体皮質のニューロン、アストロサイト、およびOPC系統の間に明確な分離が観察されたが、成人SVZおよび隣接する線条体におけるPAX6+およびOLIG2+集団の間で同様の分離は観察されなかった。
SVZからのいくつかのアストロサイトが低レベルのOLIG2を発現する可能性があるが、収集された集団はqPCRによってのみ検証された(データは示されていない)。したがって、下流のRNAシーケンシングは、これらの集団の純度をさらに定義するのに役立つ可能性がある。さらに、このプロトコルは、集団特異的核マーカーを用いて凍結胎児脳組織および脳腫瘍組織から核を単離するように適合させることができる。これらの組織はかなり細胞性が高いため、核の凝集を最小限に抑えるために、より少ない組織から始めることが役立つ場合があります。新生物組織から異数核を選別する場合、DAPIゲーティングは潜在的に高い蛍光を考慮するように調整される。現在のプロトコルは非新生物サンプルについてのみ検証されているため、新生物組織に対してFANを実行する前に、ユーザーが慎重な検証を行うことを強くお勧めします。全体として、上記のプロトコルは、ニューロンを濃縮するために以前に確立されたプロトコルから適応された、濃縮されたアストロサイト集団を単離するための検証済みの戦略を提案する。この方法論は、さらなる分子分析に使用するために、正常な脳組織および罹患した皮質脳組織の両方からアストロサイト核集団を効果的に単離するために使用することができる。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、シナイ山のアイカーン医科大学の病理学および脳神経外科のメンバーに、同定解除された脳組織の調達を支援してくれたこと、および専門家のアドバイスを求めるISMMSのフローサイトメトリーCOREに感謝します。この研究は、NIH RF1DA048810、R01NS106229、R03NS101581(N.M.T.へ)、およびR61DA048207(SAへ)から部分的に資金提供を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S.
- Akbarian, S., et al.
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al.
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
