Denne protokol har til formål at visualisere heterochromatin aggregater i Drosophila polytene celler.
Visualisering af heterochromatin aggregater ved immunostaining kan være udfordrende. Mange pattedyr komponenter af kromatin er bevaret i Drosophila melanogaster. Derfor er det en fremragende model til at studere heterochromatindannelse og vedligeholdelse. Polyteniserede celler, som dem, der findes i spytkirtler af tredje instar D. melanogaster larver, giver et glimrende værktøj til at observere kromatin forstærket næsten tusind gange og har gjort det muligt for forskere at studere ændringer i fordelingen af heterochromatin i kernen. Selv om observationen af heterochromatinkomponenter kan udføres direkte i polytenkromosompræparater, kan lokaliseringen af nogle proteiner ændres ved behandlingens sværhedsgrad. Derfor supplerer den direkte visualisering af heterochromatin i celler denne type undersøgelse. I denne protokol beskriver vi de immunostainingteknikker, der anvendes til dette væv, brugen af sekundære fluorescerende antistoffer og konfokal mikroskopi for at observere disse heterochromatinaggregater med større præcision og detaljer.
Siden de tidlige undersøgelser af Emil Heitz1, heterochromatin er blevet betragtet som en vigtig regulator af cellulære processer som genekspression, meiotisk og mitotisk adskillelse af kromosomer og opretholdelse af genomstabilitet2,3,4.
Heterochromatin er hovedsageligt opdelt i to typer: konstituerende heterochromatin, der karakteristisk definerer gentagne sekvenser, og transponerbare elementer, der er til stede på specifikke kromosomsteder såsom telomerer og centromerer. Denne type heterochromatin defineres hovedsageligt epigentisk ved specifikke histonemærker såsom di eller tri-methylering af lysin 9 af histone H3 (H3K9me3) og binding af Heterochromatinproteinet 1a (HP1a)5,6. På den anden side lokaliserer fakultets heterochromatin gennem kromosomets arme og består hovedsageligt af udviklingst bragt til tavshed gener7,8. Immunostaining af heterochromatinblokke i metafaseceller eller observation af heterochromatinaggregater i interfaseceller har afsløret meget lys i forståelsen af dannelsen og funktionen af heterokromatiske regioner9.
Brugen af Drosophila som modelsystem har gjort det muligt at udvikle vigtige værktøjer til at studere heterochromatin uden brug af elektronmikroskopi10. Siden beskrivelsen af positionseffektvariation og opdagelsen af heterochromatin-associerede proteiner, såsom HP1a, og histone postoversættelsesændringer, har mange grupper udviklet flere immunohistokemiske teknikker, der tillader visualisering af disse heterokromatiske regioner10,11.
Disse teknikker er baseret på brugen af specifikke antistoffer, der genkender heterochromatin-associerede proteiner eller histonemærker. For hver celletype og antistof skal fikserings- og gennemtrængningsbetingelserne bestemmes empirisk. Forholdene kan også variere, hvis der anvendes yderligere mekaniske processer såsom squashteknikker. I denne protokol beskriver vi brugen af Drosophila spytkirtler til at studere heterokromatisk foci. Spytkirtler har polyteniserede celler, der indeholder mere end 1.000 kopier af genomet, hvilket giver et forstærket billede af de fleste af kromatinfunktionerne, med undtagelse af satellit-DNA og nogle heterokromatiske regioner, der er under replikeret. Ikke desto mindre visualiseres heterochromatinområder let i polytene kromosompræparater, men squashteknikkerne kan undertiden forstyrre karakteristiske chromatin-bundne komplekser eller chromatinarkitekturen. Derfor kan immunolocalisering af proteiner i hele spytkirtelvæv overgå disse uønskede virkninger. Vi har brugt denne protokol til at opdage flere chromatinbundne proteiner, og vi har vist, at denne protokol kombineret med mutante Drosophila-bestande kan bruges til at studere heterochromatinforstyrrelser12.
Den cellulære funktion af eukaryote organismer kan definere 3D-strukturen i kernen, som understøttes af interaktioner mellem forskellige proteiner med kromatin og forskellige molekyler, herunder RNA. I de sidste tre år har de biologiske kondensater, der har haft relevans, herunder heterochromatin, taget en grundlæggende rolle i bestemmelsen af faseadskillelse, der fremmer den særskilte nukleare rumlige organisering af aktiv og undertrykkende chromatin 16,17<…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Marco Antonio Rosales Vega og Abel Segura for at tage nogle af de konfokale billeder, Carmen Muñoz for medieforberedelse og Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui og Dr. Chris Wood fra LMNA for at få råd om brugen af mikroskoperne.
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22×22, brand not critical |
DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
EGTA | brand not critical | ||
Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
NaOH | brand not critical | ||
PIPES | brand not critical | ||
Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |