Immunfluorescerende farvning til visualisering af heterochromatin associerede proteiner i Drosophila Spytkirtler

Summary

Denne protokol har til formål at visualisere heterochromatin aggregater i Drosophila polytene celler.

Abstract

Visualisering af heterochromatin aggregater ved immunostaining kan være udfordrende. Mange pattedyr komponenter af kromatin er bevaret i Drosophila melanogaster. Derfor er det en fremragende model til at studere heterochromatindannelse og vedligeholdelse. Polyteniserede celler, som dem, der findes i spytkirtler af tredje instar D. melanogaster larver, giver et glimrende værktøj til at observere kromatin forstærket næsten tusind gange og har gjort det muligt for forskere at studere ændringer i fordelingen af heterochromatin i kernen. Selv om observationen af heterochromatinkomponenter kan udføres direkte i polytenkromosompræparater, kan lokaliseringen af nogle proteiner ændres ved behandlingens sværhedsgrad. Derfor supplerer den direkte visualisering af heterochromatin i celler denne type undersøgelse. I denne protokol beskriver vi de immunostainingteknikker, der anvendes til dette væv, brugen af sekundære fluorescerende antistoffer og konfokal mikroskopi for at observere disse heterochromatinaggregater med større præcision og detaljer.

Introduction

Siden de tidlige undersøgelser af Emil Heitz¹, heterochromatin er blevet betragtet som en vigtig regulator af cellulære processer som genekspression, meiotisk og mitotisk adskillelse af kromosomer og opretholdelse af genomstabilitet^2,3,4.

Heterochromatin er hovedsageligt opdelt i to typer: konstituerende heterochromatin, der karakteristisk definerer gentagne sekvenser, og transponerbare elementer, der er til stede på specifikke kromosomsteder såsom telomerer og centromerer. Denne type heterochromatin defineres hovedsageligt epigentisk ved specifikke histonemærker såsom di eller tri-methylering af lysin 9 af histone H3 (H3K9me3) og binding af Heterochromatinproteinet 1a (HP1a)^5,6. På den anden side lokaliserer fakultets heterochromatin gennem kromosomets arme og består hovedsageligt af udviklingst bragt til tavshed gener^7,8. Immunostaining af heterochromatinblokke i metafaseceller eller observation af heterochromatinaggregater i interfaseceller har afsløret meget lys i forståelsen af dannelsen og funktionen af heterokromatiske regioner⁹.

Brugen af Drosophila som modelsystem har gjort det muligt at udvikle vigtige værktøjer til at studere heterochromatin uden brug af elektronmikroskopi¹⁰. Siden beskrivelsen af positionseffektvariation og opdagelsen af heterochromatin-associerede proteiner, såsom HP1a, og histone postoversættelsesændringer, har mange grupper udviklet flere immunohistokemiske teknikker, der tillader visualisering af disse heterokromatiske regioner^10,11.

Disse teknikker er baseret på brugen af specifikke antistoffer, der genkender heterochromatin-associerede proteiner eller histonemærker. For hver celletype og antistof skal fikserings- og gennemtrængningsbetingelserne bestemmes empirisk. Forholdene kan også variere, hvis der anvendes yderligere mekaniske processer såsom squashteknikker. I denne protokol beskriver vi brugen af Drosophila spytkirtler til at studere heterokromatisk foci. Spytkirtler har polyteniserede celler, der indeholder mere end 1.000 kopier af genomet, hvilket giver et forstærket billede af de fleste af kromatinfunktionerne, med undtagelse af satellit-DNA og nogle heterokromatiske regioner, der er under replikeret. Ikke desto mindre visualiseres heterochromatinområder let i polytene kromosompræparater, men squashteknikkerne kan undertiden forstyrre karakteristiske chromatin-bundne komplekser eller chromatinarkitekturen. Derfor kan immunolocalisering af proteiner i hele spytkirtelvæv overgå disse uønskede virkninger. Vi har brugt denne protokol til at opdage flere chromatinbundne proteiner, og vi har vist, at denne protokol kombineret med mutante Drosophila-bestande kan bruges til at studere heterochromatinforstyrrelser¹².

Protocol

1. Tredje instar larver kultur Forbered 1 liter standardmedier ved at tilsætte 100 g gær, 100 g uraffineret hele rørsukker, 16 g agar, 10 ml propionsyre og 14 g gelatine. Opløs alle ingredienser undtagen gær i 800 mL vand fra hanen og derefter opløse gær. Autoklave straks i 30 minutter. Lad derefter mediet køle ned til 60 °C og tilsæt propionsyre til en endelig koncentration 0,01%. Lad flasken stå, indtil gelatinen er dannet. For at optimere 3o instar larverkulturen ska…

Representative Results

Repræsentative resultater af HP1a immunostaining i Drosophila spytkirtler er vist i figur 1. Et positivt resultat er at observere et omdrejningspunkt (figur 1a) (heterokromatisk aggregat eller kondensat). Et negativt resultat er intet signal eller et spredt signal. Nogle gange kan der observeres et dobbelt signal, det vil sige med et dobbeltpunkt (Figur 1c), men det forekommer normalt i mindre mængder. <p class="jove_…

Discussion

Den cellulære funktion af eukaryote organismer kan definere 3D-strukturen i kernen, som understøttes af interaktioner mellem forskellige proteiner med kromatin og forskellige molekyler, herunder RNA. I de sidste tre år har de biologiske kondensater, der har haft relevans, herunder heterochromatin, taget en grundlæggende rolle i bestemmelsen af faseadskillelse, der fremmer den særskilte nukleare rumlige organisering af aktiv og undertrykkende chromatin ^16,17<…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen MCT-150-C	11351904	brand not critical
16% formaldehyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22×22, brand not critical
DTT	Sigma	d9779	brand not critical
EDTA	Sigma	E5134	brand not critical
EGTA			brand not critical
Glass slide	Gold seal	3011	brand not critical
H3BO3	Baker	0084-01	brand not critical
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	brand not critical
Methanol	Baker	9070-03	brand not critical
NaCl	Sigma	71376	brand not critical
NaOH			brand not critical
PIPES			brand not critical
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	brand not critical
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, brand not critical