تقدم هذه الورقة طريقة تطوير وتوصيف وتتبع في الوقت الفعلي ورم خبيث في نموذج الزرد من الورم الأرومي العصبي ، وتحديدا في خط الزرد المعدل وراثيا مع الإفراط في التعبير عن MYCN و LMO1 ، والذي يتطور ورم خبيث تلقائيا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
برزت أسماك الزرد كنموذج حيواني مهم لدراسة الأمراض البشرية ، وخاصة السرطان. جنبا إلى جنب مع تقنيات تحرير الجينات والجينوم القوية المطبقة في نمذجة أسماك الزرد ، فإن سهولة الصيانة والإنتاجية عالية الغلة والتصوير الحي القوي تجعل من الزرد نظاما نموذجيا قيما لدراسة ورم خبيث وقواعد خلوية وجزيئية كامنة وراء هذه العملية في الجسم الحي. تم تطوير أول نموذج للورم الأرومي العصبي لأسماك الزرد (NB) من ورم خبيث عن طريق الإفراط في التعبير عن اثنين من الجينات السرطانية ، MYCN و LMO1 ، تحت سيطرة مروج الدوبامين - بيتا - هيدروكسيلاز (dβh). أدى الإفراط في التعبير المشترك عن MYCN و LMO1 إلى تقليل الكمون وزيادة اختراق الورم الأرومي العصبي ، بالإضافة إلى تسارع الانبثاث البعيد للخلايا السرطانية. ويكرر هذا النموذج الجديد بشكل موثوق العديد من السمات الرئيسية للنموي البشري الخبيث، بما في ذلك مشاركة التعديلات الجينية ذات الصلة سريريا والمرتبطة بالانبثاث؛ التطور الطبيعي والتلقائي للورم الخبيث في الجسم الحي ؛ والمواقع المحفوظة من النقائل. لذلك ، يمتلك نموذج الزرد مزايا فريدة لتشريح العملية المعقدة لورم خبيث في الجسم الحي.
المقدمة
تم استخدام الزرد على نطاق واسع وتطبيقه على العديد من مجالات البحث ، وخاصة في مجال السرطان. يوفر هذا النموذج العديد من المزايا - مثل تكاثره القوي ، وصيانته الفعالة من حيث التكلفة ، والتصور متعدد الاستخدامات لنمو الورم والانبثاث - وكلها تجعل من الزرد أداة قوية لدراسة والتحقيق في القواعد الخلوية والجزيئية لتكوين الورم والانبثاث. وقد أدت التقنيات الجديدة لرسم خرائط الجينوم على نطاق واسع، والتحول الجنسي، والتعبير المفرط عن الجينات أو الضربة القاضية، وزرع الخلايا، والشاشات الكيميائية إلى زيادة كبيرة في قوة نموذج الزرد1. خلال السنوات القليلة الماضية ، تم تطوير العديد من خطوط الزرد لدراسة تكوين الأورام والانبثاث لمجموعة متنوعة من أنواع السرطان البشرية ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع طرق البحث باستخدام أسماك الزرد ورعاية/صيانة الحيوانات وفقا للإرشادات المؤسسية في Mayo Clinic.
1. التحضير والحقن المجهري للتركيبات الجينية المحورة لتطوير خط الزرد المحورة وراثيا LMO1 مع الإفراط في التعبير في PSNS
- لتطوير استنساخ دخول LMO1-pDONR221 ، تضخيم منطقة ترميز LMO1 البشري من cDNA التي تم الحصول عليها من خط الخلايا البشرية باستخدام PCR.
- قم بعمل تفاعل 25 ميكرولتر كما هو مفصل هنا: 2.5 ميكرولتر من 10x معيار Taq Reaction Buffer ، 0.125 μL من Taq DNA Polymerase ، 0.5 μL من 10 mM dNTPs ، 2 μL من قالب cDNA ، 0.5 μL من 10 μM إلى الأمام LMO1 ATTB1 التمهيدي ، 0.5 ميكرولت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتحديد ما إذا كان LMO1 يتآزر مع MYCN للتأثير على التسبب في NB ، تم حقن التركيبات المعدلة وراثيا التي تدفع التعبير عن LMO1 (dβh: LMO1 و dβh: mCherry) أو MYCN (dβh: EGFP-MYCN) في خلايا PSNS الخاضعة لسيطرة مروج dβh في أجنة أسماك الزرد 13. وكما هو مبين في الشكل 1 ألف، بعد تطوير خطوط معدلة وراثيا مستقرة والتحقق من صحة أنماطها الجينية، تزاوجت أسماك MYCN و LMO1 غير المتجانسة. تم فرز ذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يشيع استخدام سمك الزرد في الأبحاث على مدى العقود القليلة الماضية ، وخاصة في أبحاث السرطان ، لأسباب واضحة ، مثل سهولة صيانته ، وتكاثره القوي ، ومزاياه الواضحة للتصوير في الجسم الحي 1،28. يمكن التلاعب بسهولة بنموذج الزرد جنينا بسبب إخصابه الخارجي وتطوره ، والذي يكمل بشكل جيد الكائنات الحية النموذجية للثدييات ، مثل الجرذان والفئران ، للدراسات الجينية واسعة النطاق1،2،3
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية منافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة R01 CA240323 (S.Z.) من المعهد الوطني للسرطان. منحة W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) من وزارة الدفاع الأمريكية (DoD) ؛ جائزة V Scholar من مؤسسة V لأبحاث السرطان (S.Z.) ومنحة منصة من مركز Mayo للاكتشاف الطبي الحيوي (S.Z.) ؛ وبدعم من مركز Mayo Clinic للسرطان ومركز الطب الفردي (S.Z).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3،3'-ديامينوبنزيدين (DAB) مجموعة ناقلات | ناقلات | SK-4100 | |
| حمض الخليك | فيشر Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| الأجسام المضادة للتيروزين هيدروكسيلاز (TH) | Pel-Freez | P40101 | |
| طقم حجب أفيدين / البيوتين | ناقلات | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND مخفف الأجسام المضادة الأولية | Leica Biosystems Newcastle، Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC أداة | Leica Biosystems Newcastle، Ltd. | N / A | نظام تلطيخ IHC مؤتمت |
| بالكامل CH211-270H11 استنساخ BAC | مركز موارد BACPAC (BRFC) | مجهر مركب N / A | |
| مجهز بكاميرا DP71 | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (وسيط تركيب قائم على الزيلين) | ريتشارد آلان Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | جاهز للاستخدام (لا حاجة للتحضير) |
| الإيثانول | كارولينا | 86-1263 | |
| توسيع نظام PCR القالب الطويل | Roche Applied Science ، IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II مزيج إنزيم | Invitrogen ، CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II مزيج إنزيم | Invitrogen ، CA | 11791-100 | |
| جسم مضاد ثانوي مضاد للماعز (بيوتينيل) | داكو | E0432 | |
| محلول الهيماتوكسيلين ، شركة Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Acid Hydrochloric | Acid Solutions | Aqua 4360-1L | |
| بيروكسيد الهيدروجين ، 3٪ | فيشر Scientific | H324-500 | |
| إنزيم SceI | نيو إنجلاند بيولوجيس ، MA | R0694L | |
| كبريتات كاناميسين | تكنوفا ، إنك. | K2150 | |
| كيمبرلي كلارك المهنية Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| كربونات الليثيوم | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome لتقسيم | Leica Biosystems | RM2255 | |
| طلقة واحدة TOP10 مختصة كيميائيا E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N / A | هدية سخية (يرجى الرجوع إلى صفحة الويب http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page للحصول على المواد ، والتي يتم توزيعها بحرية كما هو موضح.) |
| شمع البارافين | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| ناقل pDEST (ناقل الوجهة المعدل الذي يحتوي على مواقع التعرف على I-SceI) | د. C. Grabher ، معهد كارلسروه للتكنولوجيا ، كارلسروه ، ألمانيا | N / A | هدية سخية |
| pDONR 221 بوابة مانحة ناقلات | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R ناقلات متبرعة | د. تشي بين شين ، جامعة يوتا | N / A | هدية سخية |
| الفينول الأحمر ، 0.5٪ | سيجما ألدريتش | P0290 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius طقم وصمة عار حمراء | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| Proteinase K ، مؤتلف ، PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO جهاز فك التشفير | السريع Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| مجهر مضان ستيريو | Leica | MZ10F | |
| مجهر مضان مجسيم مزود بكاميرا DS-U1 للتصوير | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs ، MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP & reg ؛ 6 الذكاء الاصطناعي معالج التسلل بالفراغ | ساكورا | N / A | نموذج #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher | Scientific X3P1GAL |
المراجع
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694(2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
