Questo documento introduce il metodo per sviluppare, caratterizzare e tracciare in tempo reale le metastasi tumorali nel modello di neuroblastoma zebrafish, in particolare nella linea transgenica zebrafish con sovraespressione di MYCN e LMO1, che sviluppa metastasi spontaneamente.
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Articolo metodologico
Zebrafish Modello di Metastasi del Neuroblastoma
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pesce zebra è emerso come un importante modello animale per studiare le malattie umane, in particolare il cancro. Insieme alle robuste tecnologie transgeniche e di editing del genoma applicate nella modellazione del pesce zebra, la facilità di manutenzione, la produttività ad alto rendimento e la potente imaging dal vivo rendono il pesce zebra un prezioso sistema modello per studiare metastasi e basi cellulari e molecolari alla base di questo processo in vivo. Il primo modello di metastasi del neuroblastoma del pesce zebra (NB) è stato sviluppato sovraesprimendo due oncogeni, MYCN e LMO1, sotto controllo del promotore della dopamina-beta-idrossilasi (dβh). MyCN e LMO1 co-sovraespressi hanno portato alla riduzione della latenza e all'aumento della penetranza della neuroblastomagenesi, nonché all'accelerazione delle metastasi a distanza delle cellule tumorali. Questo nuovo modello ribadisce in modo affidabile molte caratteristiche chiave della NB metastatica umana, incluso il coinvolgimento di alterazioni genetiche clinicamente rilevanti e associate a metastasi; sviluppo naturale e spontaneo di metastasi in vivo; e siti conservati di metastasi. Pertanto, il modello zebrafish possiede vantaggi unici per sezionare il complesso processo di metastasi tumorali in vivo.
Introduzione
Zebrafish è stato ampiamente utilizzato e applicato a diverse aree di ricerca, in particolare nel cancro. Questo modello offre molti vantaggi, come la sua riproduzione robusta, la manutenzione economica e la visualizzazione versatile della crescita tumorale e delle metastasi, che rendono il pesce zebra un potente strumento per studiare e studiare le basi cellulari e molecolari della tumorigenesi e delle metastasi. Nuove tecniche per la mappatura del genoma su larga scala, la transgenesi, la sovraespressione o il knockout dei geni, il trapianto di cellule e gli schermi chimici hanno aumentato immensamente la potenza del modello di pesce zebra1. ....
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Protocollo
Tutti i metodi di ricerca che utilizzano il pesce zebra e la cura / manutenzione degli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della Mayo Clinic.
1. Preparazione e microiniezione di costrutti transgenici per lo sviluppo della linea LMO1 transgenica zebrafish con sovraespressione in PSNS
- Per sviluppare il clone di ingresso LMO1-pDONR221 , amplificare la regione codificante di LMO1 umano dal cDNA ottenuto dalla linea cellulare umana utilizzando la PCR.
- Effettuare una reazione da 25 μL come descritto qui: 2,5 μL di 10x Taq Reaction Buffer standard, 0,125 μ....
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Risultati
Per determinare se LMO1 sinergizza con MYCN per influenzare la patogenesi NB, i costrutti transgenici che guidano l'espressione di LMO1 (dβh:LMO1 e dβh:mCherry) o MYCN (dβh:EGFP-MYCN) nelle cellule PSNS sotto controllo del promotore dβh sono stati iniettati negli embrioni di zebrafish13. Come illustrato nella Figura 1A, dopo lo sviluppo di linee transgeniche stabili e la convalida dei loro genotip.......
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Discussione
Il pesce zebra è stato comunemente utilizzato nella ricerca negli ultimi decenni, in particolare nella ricerca sul cancro, per ovvi motivi, come la sua facilità di manutenzione, la riproduzione robusta e chiari vantaggi per l'imaging in vivo1,28. Il modello del pesce zebra può essere facilmente manipolato embrionalmente a causa della loro fecondazione e sviluppo esterni, che si integra bene con gli organismi modello dei mammiferi, come ratti e topi, per .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione R01 CA240323 (S.Z.) del National Cancer Institute; una sovvenzione W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (DoD); un V Scholar award dalla V Foundation for Cancer Research (S.Z.) e un Platform Grant dal Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); e i supporti del Mayo Clinic Cancer Center e del Center for Individualized Medicine (S.Z.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit vettoriale 3,3'-diaminobenzidina (DAB) | Vettore | SK-4100 | |
| Acido acetico | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarosio GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH) | Pel-Freez | P40101 | |
| Kit di blocco avidina/biotina | Vettore | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND Diluente per anticorpi primari | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| Strumento BOND-MAX IHC Leica | Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | sistema di colorazione IHC completamente automatizzato |
| CH211-270H11 Clone BAC | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Microscopio composto dotato di fotocamera DP71 | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (terreno di montaggio a base di xilene) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | pronto all'uso (non è necessaria alcuna preparazione) |
| Etanolo | Carolina | 86-1263 | |
| Espandi il sistema PCR a modello lungo | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonasi II miscela di enzimi | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonasi II miscela di enzimi | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Anticorpo secondario anti-Rb di capra (biotinilato) | Dako | E0432 | |
| Soluzione di ematossilina, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Acido cloridrico Soluzioni | acquatiche | 4360-1L | |
| Perossido di idrogeno, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzima | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamicina solfato | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Carbonato di litio | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtomo per sezionamento | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chimicamente competente E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | un dono generoso (Si prega di fare riferimento alla pagina web http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page per ottenere materiale, che viene distribuito liberamente come descritto.) |
| Cera di parafina | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin a |
| parafina Paraformaldeide | Alfa Aesar | A11313 | |
| vettore pDEST (vettore di destinazione modificato contenente siti di riconoscimento I-SceI) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germania | N/A | un generoso regalo |
| pDONR 221 gateway donatore vettore | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| Vettore donatore pDONRP4-P1R | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | un generoso dono |
| Rosso fenolo, 0,5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Kit di colorazione rossa Picrosirrius | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| Proteinasi K, ricombinante, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Decalcificante rapido | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Azoturo di sodio (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Microscopio a fluorescenza stereo | Leica | MZ10F | |
| Microscopio a fluorescenza stereoscopico dotato di mirino digitale Fotocamera DS-U1 per l'imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polimerasi | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 Processore di infiltrazione sottovuoto AI | Sakura | N/A | Modello #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
Riferimenti
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694(2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <....
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Ristampe e permessi
