Her er protokoller for innsamling og mikroinjeksjon av precellulære maisplantehopperembryoer med det formål å modifisere genomet deres via CRISPR / Cas9-basert genomredigering eller for tilsetning av markerte transponerbare elementer gjennom kimlinjetransformasjon.
Maisplanthopperen, Peregrinus maidis, er et på mais og en vektor av flere maisvirus. Tidligere publiserte metoder beskriver utløsing av RNA-interferens (RNAi) i P. maidis gjennom mikroinjeksjon av dobbeltstrengede RNA (dsRNA) i nymfer og voksne. Til tross for kraften til RNAi, er fenotyper generert via denne teknikken forbigående og mangler langsiktig mendelsk arv. Derfor må P. maidis-verktøykassen utvides til å omfatte funksjonelle genomiske verktøy som vil muliggjøre produksjon av stabile mutantstammer, og åpne døren for forskere å bringe nye kontrollmetoder til å bære på dette økonomisk viktige. Imidlertid, i motsetning til dsRNAene som brukes til RNAi, krysser komponentene som brukes i CRISPR / Cas9-basert genomredigering og kimlinjetransformasjon ikke lett cellemembraner. Som et resultat må plasmid-DNA, RNA og / eller proteiner mikroinjiseres i embryoer før embryocellulariseringen, noe som gjør tidspunktet for injeksjon en kritisk faktor for suksess. For dette formål ble en agarosebasert eggleggingsmetode utviklet for å tillate embryoer å bli høstet fra P. maidis-hunner med relativt korte intervaller. Her er gitt detaljerte protokoller for innsamling og mikroinjeksjon av precellulære P. maidis-embryoer med CRISPR-komponenter (Cas9-nuklease som har blitt kompleksert med guide-RNA), og resultater av Cas9-basert genknockout av et P. maidis øyenfargegen, hvitt, presenteres. Selv om disse protokollene beskriver CRISPR/Cas9-genomredigering i P. maidis, kan de også brukes til å produsere transgen P. maidis via kimlinjetransformasjon ved ganske enkelt å endre sammensetningen av injeksjonsoppløsningen.
Maisplantehopperen, Peregrinus maidis, er et økonomisk viktig på mais 1,2,3. De forårsaker direkte fysisk skade på planten, både mens de spiser med sine piercing-sugende munndeler, og under reproduksjon når de legger embryoene sine direkte inn i plantevev 2,4. Til tross for de mange rutene for direkte skade på avlinger, er den største effekten disse insektene har på avlingshelsen indirekte, ved å fungere som vektor av maismosaikkvirus (MMV) og maisstripevirus 5,6. MMV er i stand til å replikere i kroppen av sin P. maidis-vektor, slik at viruset kan vedvare i individuelle insekter gjennom hele livet, slik at de kan fortsette å spre viruset til nye vertsplanter 7,8. De vanligste metodene for å kontrollere P. maidis, og dermed virusene det vektorer, er insektmidler.
Dessverre har dårlig forvaltning av disse produktene forårsaket utvikling av resistens i målskadedyret samt forurensning av miljøet9. Derfor er det behov for nye strategier for å redusere avlingstap fra denne insekt / virus-skadedyrskombinasjonen. Tidligere arbeid viste at RNA-interferens (RNAi) kan være en effektiv kontrollmetode for P. maidis fordi de er utsatt for nedregulering i genuttrykk selv ved inntak av dobbeltstrenget RNA (dsRNA)10. Imidlertid vil den mest effektive måten å administrere dsRNA i feltet være gjennom plantene insektene spiser på; Derfor kan avlinger fortsatt være utsatt for virus insektene allerede bærer. Med fremkomsten av CRISPR / Cas9-genomredigering, er nye skadedyrbekjempelsesstrategier mulige, inkludert Cas9-basert gendrift11,12, som kan brukes til å redusere størrelsen på en skadedyrpopulasjon, eller for å erstatte befolkningen med individer som er resistente mot virusene de vektor.
Imidlertid vil utvikling og distribusjon av enhver type gen-drive system kreve utvikling av transgene teknikker. Slike metoder var ikke nødvendige for å utføre RNAi-eksperimenter i P. maidis fordi dsRNA og/eller siRNA antas å kunne krysse cellemembraner på grunn av effektiviteten av RNAi i P. maidis10,13. Dette er ikke sant for DNAer og / eller proteiner som brukes i tradisjonell transgenese eller i Cas9-basert genredigering, som begge ville være en forløper for å skape insekter som bærer en gendrift. For å oppnå genredigering eller andre former for kimlinjetransformasjon, blir disse DNAene og proteinene ideelt mikroinjisert i embryoer under syncytial blastodermstadiet, før når insektembryoet cellulariseres. Timing er kritisk, fordi syncytialstadiet er den tidligste delen av utviklingen14,15. Siden P. maidis-hunner fortrinnsvis legger eggene sine i plantevev, kan det være arbeidskrevende og tidkrevende å trekke ut tilstrekkelige mengder precellulære embryoer til mikroinjeksjoner. Derfor ble nye teknikker utviklet for raskt å samle og mikroinjisere P. maidis-embryoer før cellularisering.
Egg-legg kvalitet og ernæring
Nylig fikk forskere som arbeider med en beslektet art, Nilaparvata lugens, eggene de brukte til mikroinjeksjoner direkte fra bladet, og holdt de injiserte eggene i bladvevet til de klekket17. Mens denne bladbaserte metoden ga et mer naturlig miljø for embryonal utvikling, økte den også sjansene for infeksjoner og for eggskader under fjerningsprosessen. Det kunstige oviposisjonssystemet som presenteres her, gir et mer ensartet miljø og reduserer sjansene for skade på eggene fra håndtering. Ved å sette opp oviposisjonskoppene på fredag, ble flertallet av eggene samlet inn i løpet av en typisk arbeidsuke, til fordel for de som gjorde mikroinjeksjonsarbeidet. En advarsel til denne metoden er imidlertid at mangelen på næringsstoffer i 10% sukroseløsningsdiet til slutt vil påvirke insektens helse, og kvinner i koppene begynner vanligvis å dø av etter bare 10 dager. Eggkvaliteten begynner også å falle av etter 6 dager, som det fremgår av en økning i døde eller usunne egg. Som et resultat er det viktig å være selektiv med eggene som brukes til mikroinjeksjoner og ikke beholde hunnene etter dag 6.
Overlevelse og fuktighet
To faktorer synes å være kritiske for embryonal overlevelse gjennom mikroinjeksjonsprosessen. Det mest utfordrende aspektet ved håndtering av P. maidis-embryoer er å hindre dem i å tørke ut etter fjerning fra oviposisjonsmediet og gjennom mikroinjeksjon. Siden eggene vanligvis legges inne i plantevev, mangler de et tilstrekkelig skall for å forhindre dehydrering. Selv i den fuktede hetten gikk hele sett med egg tapt på grunn av uttørking. For høy luftfuktighet kan imidlertid også påvirke mikroinjeksjonene hvis det samler seg vann på dobbeltsidig tape eller på skopet. Dessverre var eggdehydrering vanligvis ikke lett å legge merke til under mikroinjeksjonsprosessen, og de virket ofte normale til 2 eller 3 dager senere, da de ble helt gjennomsiktige, og viste ingen tegn på utvikling.
Nålekvalitet ser også ut til å spille en viktig rolle for overlevelse. Nålen skal skråstilles for å minimere unødvendig skade på egget. Når nålen er tett, vil nålen brukes til en funksjonell tilstand ved hjelp av clearingfunksjonen på injektoren mens du forsiktig stryker på kanylespissen med en fuktet pensel (se trinn 4.7). Uansett anbefales det å sette bare små mengder injeksjonsoppløsning (~0,25 μL) i hver nål og bytte til en ny nål med noen få lysbilder (~50-60 egg) for å sikre at nålekvaliteten opprettholdes gjennom hele injeksjonsprosessen.
Vellykket generasjon av en knockout-fenotype
For å lykkes med å transformere bakteriecellene, må embryomikroinjeksjoner vanligvis gjøres så tidlig som mulig før cellularisering. Avhengig av insektarten, varierer tidsvinduet for å fullføre mikroinjeksjonene fra bare et par timer til så lenge som en hel dag14,15,20. Det er fortsatt uklart når P. maidis-embryoer gjennomgår cellularisering. Cas9-mediert knockout ble testet på embryoer så unge som 4 timer etter egglegging (pel) til så mange som 16 timers pel, og de forventede fenotypene ble observert i alle eksperimenter, noe som tyder på at alle mikroinjeksjoner ble utført innenfor precelluriseringsvinduet.
P. maidis ortholog av øyenfargegenet, hvit, ble valgt fordi knockout-fenotypen ble forventet å være lett å screene hos injektører på grunn av sin celleautonome natur. Faktisk, som forventet, var både mosaikk og totale knockouts tydelig identifiserbare blant embryoer som mottok injeksjonsblandingen som inneholdt Cas9 og guide-RNA. Dessverre klekket ingen injektorer med fullstendig knockout, og en masseparring av overlevende injektorer klarte ikke å generere hvitøyet avkom. Imidlertid ble en mutant linje senere vellykket generert ved å målrette et annet gen (Klobasa et al., pågår). Dette antyder at manglende etablering av en hvit mutantlinje mest sannsynlig skyldes enten off-target effekter (dvs. Cas9 kutte viktige regioner andre steder i genomet) som genererer en nært knyttet dødelig mutasjon, eller til en uforutsigbar kritisk rolle for hvit i P. maidis.
Fenotypiske og molekylære data (figur 8 og figur 9) bekrefter at en signifikant knockout i det hvite lokuset ble opprettet i en prøve av injiserte embryoer, noe som ville resultere i totalt tap av genfunksjon. Dessuten, mens mutasjoner i hvitt er levedyktige hos noen arter, er det presedens for at redusert hvit aktivitet er skadelig21,22. Når det er sagt, kan ikke off-target effekter utelukkes helt. Å forutsi sannsynlige off-targets krever nøyaktige genomsekvensdata23, som den nåværende tilstanden til genomiske ressurser i P. maidis gjør umulig å gjøre på dette tidspunktet. Uansett, med disse nye metodene, kan testing av andre målgener gjøres trygt, til og med bevege seg mot mer tradisjonell transgenese i et forsøk på å bringe nye genetiske verktøy til dette skadelige.
The authors have nothing to disclose.
North Carolina State University, Institutt for entomologi og plantepatologi, er en del av et team som støtter DARPAs Insect Alllies Program. Synspunktene, meningene og / eller funnene som er uttrykt er forfatternes og bør ikke tolkes som å representere de offisielle synspunktene eller retningslinjene til forsvarsdepartementet eller den amerikanske regjeringen. Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser. MDL, DR og AEW unnfanget prosjektet og ga finansieringsoppkjøp, prosjektadministrasjon og ressurser. FC, WK, NG og MDL unnfanget og designet mikroinjeksjonseksperimentene; OH unnfanget og designet eggleggingsmetoden. FC og WK utførte eksperimentene; FC og WK analyserte resultatene; og FC, WK, NG og MDL skrev manuskriptet. Forfatterne ønsker å gi spesiell takk til Kyle Sozanski og Victoria Barnett for deres hjelp med å opprettholde P. maidis-kolonier.
1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
Guide RNA 1 – GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 2 – UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 3 – GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
Primer – PmW CRISPR check F1 – AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R1 – GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check F3 – TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R3 – GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |