Här finns protokoll för insamling och mikroinjicering av precellulära majsplanthopparembryon i syfte att modifiera deras genom via CRISPR / Cas9-baserad genomredigering eller för tillägg av markerade transposerbara element genom germline transformation.
Majshopparen, Peregrinus maidis, är ett skadedjur av majs och en vektor av flera majsvirus. Tidigare publicerade metoder beskriver utlösandet av RNA-interferens (RNAi) i P. maidis genom mikroinjektion av dubbelsträngade RNA (dsRNA) till nymfer och vuxna. Trots kraften hos RNAi är fenotyper som genereras via denna teknik övergående och saknar långsiktigt mendelskt arv. Därför måste P. maidis verktygslåda utvidgas till att omfatta funktionella genomiska verktyg som skulle möjliggöra produktion av stabila mutanta stammar, vilket öppnar dörren för forskare att använda nya bekämpningsmetoder för denna ekonomiskt viktiga skadegörare. Men till skillnad från dsRNA som används för RNAi, korsar komponenterna som används i CRISPR / Cas9-baserad genomredigering och germlinetransformation inte lätt cellmembran. Som ett resultat måste plasmid-DNA, RNA och / eller proteiner mikroinjiceras i embryon innan embryot celluleras, vilket gör tidpunkten för injektion till en kritisk faktor för framgång. För detta ändamål utvecklades en agarosbaserad äggläggningsmetod för att göra det möjligt att skörda embryon från P. maidis honor med relativt korta intervall. Här tillhandahålls detaljerade protokoll för insamling och mikroinjicering av precellulära P. maidis embryon med CRISPR-komponenter (Cas9-nukleas som har komplexiserats med guide-RNA), och resultat av Cas9-baserad genknockout av en P. maidis ögonfärgsgen, vit, presenteras. Även om dessa protokoll beskriver CRISPR/Cas9-genomredigering i P. maidis, kan de också användas för att producera transgen P. maidis via germline transformation genom att helt enkelt ändra sammansättningen av injektionslösningen.
Majshopparen, Peregrinus maidis, är en ekonomiskt viktig skadegörare på majs 1,2,3. De orsakar direkt fysisk skada på växten, både när de matar med sina piercing-sugande mundelar och under reproduktion när de lägger sina embryon direkt i växtvävnad 2,4. Trots de många vägarna för direkt skada på grödor är den största inverkan dessa insekter har på grödans hälsa indirekt genom att fungera som vektor för majsmosaikvirus (MMV) och majsrandvirus 5,6. MMV kan replikera i kroppen av sin P. maidis vektor, vilket gör att viruset kan kvarstå i enskilda insekter under hela deras liv, så att de kan fortsätta att sprida viruset till nya värdväxter 7,8. De vanligaste metoderna för att kontrollera P. maidis, och därmed de virus som den vektorer, är insekticider.
Tyvärr har misskötsel av dessa produkter orsakat resistensutveckling hos målskadegöraren samt förorening av miljön9. Därför behövs nya strategier för att minska skördeförlusterna från denna kombination av insekter och virus-skadedjur. Tidigare arbete visade att RNA-interferens (RNAi) kan vara en effektiv kontrollmetod för P. maidis eftersom de är mottagliga för nedreglering i genuttryck även vid intag av dubbelsträngat RNA (dsRNA)10. Det mest effektiva sättet att administrera dsRNA i fältet skulle dock vara genom växterna som insekterna matar på; Därför kan grödor fortfarande vara mottagliga för eventuella virus som insekterna redan bär. Med tillkomsten av CRISPR / Cas9-genomredigering är nya skadedjursbekämpningsstrategier möjliga, inklusive Cas9-baserad gendrivare11,12, som kan användas för att minska storleken på en skadedjurspopulation eller för att ersätta nämnda population med individer som är resistenta mot de virus de vektor.
Utveckling och användning av alla typer av gendrivsystem kommer dock att kräva utveckling av transgena tekniker. Sådana metoder var inte nödvändiga för att utföra RNAi-experiment i P. maidis eftersom dsRNA och / eller siRNA antas kunna korsa cellmembran på grund av effektiviteten av RNAi i P. maidis10,13. Detta är inte sant för DNA och / eller proteiner som används i traditionell transgenes eller i Cas9-baserad genredigering, som båda skulle vara en föregångare till att skapa insekter som bär en gendrift. För att åstadkomma genredigering eller andra former av könscellsomvandling mikroinjiceras dessa DNA och proteiner idealiskt i embryon under syncytial blastoderm-stadiet, innan insektsembryot cellulariserar. Timing är kritisk, eftersom syncytialstadiet är den tidigaste delen av utvecklingen14,15. Eftersom P. maidis honor företrädesvis lägger sina ägg i växtvävnad kan det vara arbetskrävande och tidskrävande att extrahera tillräckliga mängder precellulära embryon för mikroinjektioner. Därför utvecklades nya tekniker för att snabbt samla in och mikroinjicera P. maidis embryon före cellularisering.
Äggläggningskvalitet och näring
Nyligen fick forskare som arbetar med en besläktad art, Nilaparvata lugens, äggen som de använde för mikroinjektioner direkt från bladet och behöll de injicerade äggen i bladvävnaden tills de kläcktes17. Medan denna bladbaserade metod gav en mer naturlig miljö för embryonal utveckling, ökade den också risken för infektioner och äggskador under borttagningsprocessen. Det artificiella ovipositionssystemet som presenteras här ger en mer enhetlig miljö och minskar risken för skador på äggen från hantering. Genom att ställa in ovipositionskopparna på fredagen samlades majoriteten av de ovipositerade äggen under en typisk arbetsvecka, till förmån för dem som gjorde mikroinjektionsarbetet. En varning för denna metod är dock att bristen på näringsämnen i 10% sackaroslösningsdieten så småningom kommer att påverka insekternas hälsa, och honor i kopparna börjar vanligtvis dö av efter bara 10 dagar. Äggkvaliteten börjar också sjunka efter 6 dagar, vilket framgår av en ökning av döda eller ohälsosamma ägg. Som ett resultat är det viktigt att vara selektiv av äggen som används för mikroinjektioner och att inte behålla honorna efter dag 6.
Överlevnad och fuktighet
Två faktorer verkar vara avgörande för embryonal överlevnad genom mikroinjektionsprocessen. Den mest utmanande aspekten av att hantera P. maidis embryon är att hålla dem från uttorkning efter avlägsnande från ovipositionsmediet och under hela mikroinjektionen. Eftersom äggen vanligtvis läggs inuti växtvävnad saknar de ett tillräckligt skal för att förhindra uttorkning. Även i den fuktade huven förlorades hela uppsättningar ägg på grund av uttorkning. För hög luftfuktighet kan dock också påverka mikroinjektionerna om vatten ackumuleras på den dubbelhäftande tejpen eller på kikarsiktet. Tyvärr var ägguttorkning vanligtvis inte lätt att märka under mikroinjektionsprocessen, och de verkade ofta normala tills 2 eller 3 dagar senare, när de blev helt transparenta och inte visade några tecken på utveckling.
Nålkvalitet verkar också spela en viktig roll för överlevnad. Nålen ska avfasas för att minimera onödig skada på ägget. När nålen är blockerad återställde nålen vanligtvis till ett funktionellt tillstånd med hjälp av rensningsfunktionen på injektorn medan du försiktigt strök nålspetsen med en fuktad pensel (se steg 4.7). Oavsett rekommenderas att endast små mängder injektionslösning (~ 0,25 μL) sätts i varje nål och byter till en ny nål med några få bilder (~ 50-60 ägg) för att säkerställa att nålkvaliteten bibehålls under hela injektionsprocessen.
Framgångsrik generering av en knockoutfenotyp
För att framgångsrikt omvandla könscellerna måste embryomikroinjektioner vanligtvis göras så tidigt som möjligt före cellularisering. Beroende på insektsart varierar tidsfönstret för att slutföra mikroinjektionerna från bara ett par timmar till så länge som en hel dag14,15,20. Det är fortfarande oklart när P. maidis embryon genomgår cellularisering. Cas9-medierad knockout testades på embryon så unga som 4 timmar efter äggläggning (pel) till så många som 16 h pel, och de förväntade fenotyperna observerades i alla experiment, vilket tyder på att alla mikroinjektioner utfördes inom precelluriseringsfönstret.
P. maidis ortolog av ögonfärgsgenen, vit, valdes eftersom knockoutfenotypen förväntades vara lätt att screena i injektioner på grund av dess cellautonoma natur. Som förväntat var både mosaik och totala knockouts tydligt identifierbara bland embryon som fick injektionsblandningen innehållande Cas9 och guide-RNA. Tyvärr kläcktes inga injektioner med fullständig knockout, och en massparning av överlevande injektionssprutor misslyckades med att generera vitögd avkomma. En mutantlinje genererades dock senare framgångsrikt genom att rikta in sig på en annan gen (Klobasa et al., pågår). Detta tyder på att misslyckandet med att etablera en vit mutantlinje troligen beror på antingen off-target-effekter (dvs. Cas9 skär viktiga regioner någon annanstans i genomet) som genererar en nära kopplad dödlig mutation eller till en oförutsägbar kritisk roll för vit i P. maidis.
Fenotypiska och molekylära data (figur 8 och figur 9) bekräftar att en signifikant knockout i den vita locus skapades i ett prov av injicerade embryon, vilket skulle resultera i total förlust av genfunktion. Dessutom, medan mutationer i vitt är livskraftiga hos vissa arter, finns det prejudikat för minskad vit aktivitet som är skadlig21,22. Som sagt, off-target effekter kan inte helt uteslutas. Att förutsäga sannolika off-targets kräver noggrann genomsekvensdata23, vilket det nuvarande tillståndet för genomiska resurser i P. maidis gör omöjligt att göra just nu. Oavsett, med dessa nya metoder kan testning av andra målgener göras med tillförsikt, till och med gå mot mer traditionell transgenes i ett försök att få nya genetiska verktyg till denna skadliga skadedjur.
The authors have nothing to disclose.
North Carolina State University, Institutionen för entomologi och växtpatologi, är en del av ett team som stöder DARPA: s insektsallierade program. De åsikter, åsikter och / eller resultat som uttrycks är författarnas och bör inte tolkas som att de representerar försvarsdepartementets eller den amerikanska regeringens officiella åsikter eller politik. Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen. MDL, DR och AEW utformade projektet och tillhandahöll finansieringsförvärv, projektadministration och resurser. FC, WK, NG och MDL utformade mikroinjektionsexperimenten; OH utformade och utformade äggläggningsmetoden. FC och WK utförde experimenten; FC och WK analyserade resultaten; och FC, WK, NG och MDL skrev manuskriptet. Författarna vill särskilt tacka Kyle Sozanski och Victoria Barnett för deras hjälp med att upprätthålla P. maidis kolonier.
1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
Guide RNA 1 – GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 2 – UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 3 – GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
Primer – PmW CRISPR check F1 – AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R1 – GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check F3 – TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R3 – GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |