Profilering van vluchtige stoffen in zwarte bessenfruit met behulp van Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry
Summary
Een headspace vaste fase micro-extractie-gas-chromatografie platform wordt hier beschreven voor snelle, betrouwbare en semi-geautomatiseerde vluchtige identificatie en kwantificering in rijpe zwarte bessenvruchten. Deze techniek kan worden gebruikt om de kennis over fruitaroma te vergroten en cultivars met verbeterde smaak te selecteren voor het doel van veredeling.
Abstract
Er is een toenemende belangstelling voor het meten van vluchtige organische stoffen (VOS) die door rijpe vruchten worden uitgestoten met het oog op het veredelen van variëteiten of cultivars met verbeterde organoleptische kenmerken en dus om de acceptatie door de consument te vergroten. Metabolomische platforms met hoge doorvoer zijn onlangs ontwikkeld om een breed scala aan metabolieten in verschillende plantenweefsels te kwantificeren, waaronder belangrijke verbindingen die verantwoordelijk zijn voor de smaak van fruit en aromakwaliteit (volatilomics). Een methode met behulp van headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) in combinatie met gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) wordt hier beschreven voor de identificatie en kwantificering van VOC’s die worden uitgestoten door rijpe zwarte bessenvruchten, een bes die zeer wordt gewaardeerd om zijn smaak en gezondheidsvoordelen.
Rijpe vruchten van zwarte bessenplanten (Ribes nigrum) werden geoogst en direct ingevroren in vloeibare stikstof. Na weefselhomogenisatie om een fijn poeder te produceren, werden monsters ontdooid en onmiddellijk gemengd met natriumchlorideoplossing. Na centrifugering werd het supernatant overgebracht in een glazen injectieflacon met natriumchloride. VOC’s werden vervolgens geëxtraheerd met behulp van een vaste-fase micro-extractie (SPME) vezel en een gaschromatograaf gekoppeld aan een ionenval massaspectrometer. Vluchtige kwantificering werd uitgevoerd op de resulterende ionchromatogrammen door piekgebied te integreren, met behulp van een specifiek m/z-ion voor elke VOS. Correcte VOS-annotatie werd bevestigd door retentietijden en massaspectra van zuivere commerciële normen te vergelijken die onder dezelfde omstandigheden als de monsters worden uitgevoerd. Meer dan 60 VOC’s werden geïdentificeerd in rijpe zwarte bessen die op contrasterende Europese locaties werden geteeld. Onder de geïdentificeerde VOC’s kunnen belangrijke aromastoffen, zoals terpenoïden en C6-vluchtige stoffen, worden gebruikt als biomarkers voor de kwaliteit van zwarte bessen. Daarnaast worden voor- en nadelen van de methode besproken, inclusief toekomstige verbeteringen. Verder is de nadruk gelegd op het gebruik van controles voor batchcorrectie en minimalisering van de driftintensiteit.
Introduction
Smaak is een essentiële kwaliteitseigenschap voor elk fruit, dat van invloed is op de acceptatie door de consument en dus de verkoopbaarheid aanzienlijk beïnvloedt. Smaakperceptie omvat een combinatie van de smaak- en reuksystemen en is chemisch afhankelijk van de aanwezigheid en concentratie van een breed scala aan verbindingen die zich ophopen in eetbare plantendelen, of in het geval van VOC’s, worden uitgestoten door de rijpe vrucht1,2. Terwijl traditionele veredeling zich heeft gericht op agronomische eigenschappen zoals opbrengst en resistentie tegen plagen, is de verbetering van de fruitkwaliteit, inclusief smaak, lang verwaarloosd vanwege de genetische complexiteit en de moeilijkheid om deze kenmerken goed te fenotyperen, wat leidt tot ontevredenheid van de consument3,4. Recente ontwikkelingen in metabolomische platforms zijn succesvol geweest in het identificeren en kwantificeren van belangrijke verbindingen die verantwoordelijk zijn voor de smaak en het aroma van fruit5,6,7,8. Bovendien maakt de combinatie van metabolietprofilering met genomische of transcriptomische hulpmiddelen de opheldering van de genetica die ten grondslag ligt aan de fruitsmaak mogelijk, wat op zijn beurt zal helpen bij het ontwikkelen van nieuwe variëteiten met verbeterde organoleptische kenmerken2,4,9,10,11,12,13,14.
Zwarte bessen (Ribes nigrum) worden zeer gewaardeerd om hun smaak en voedingseigenschappen en worden op grote schaal gekweekt in de gematigde zones van Europa, Azië en Nieuw-Zeeland15. Het grootste deel van de productie wordt verwerkt voor voedingsmiddelen en dranken, die erg populair zijn in de Scandinavische landen, voornamelijk vanwege de organoleptische eigenschappen van de bessen. De intense kleur en smaak van de vrucht zijn het resultaat van een combinatie van anthocyanen, suikers, zuren en VOC’s die aanwezig zijn in de rijpe vruchten16,17,18. De analyse van vluchtige zwarte bessen gaat terug tot de jaren 196019,20,21. Meer recent hebben verschillende studies zich gericht op VOS van zwarte bessen, het identificeren van belangrijke verbindingen voor de perceptie van fruitaroma’s en het beoordelen van de impact van genotype, omgeving of opslag- en verwerkingsomstandigheden op VOC-inhoud5,17,18,22,23.
Vanwege de vele voordelen is de voorkeurstechniek voor vluchtige profilering met hoge doorvoer HS-SPME/GC-MS24,25. Een silicavezel, bedekt met een polymere fase, wordt op een spuitapparaat gemonteerd, waardoor de adsorptie van de vluchtige stoffen in de vezel mogelijk is totdat een evenwichtsfase is bereikt. Headspace extractie beschermt de vezel tegen de niet-vluchtige verbindingen die aanwezig zijn in de matrix24. SPME kan met succes een groot aantal VOS isoleren die aanwezig zijn in zeer variabele concentraties (delen per miljard tot delen per miljoen)25. Bovendien is het een oplosmiddelvrije techniek die beperkte monsterverwerking vereist. Andere voordelen van HS-SPME zijn het automatiseringsgemak en de relatief lage kosten.
Het succes ervan kan echter beperkt zijn, afhankelijk van de chemische aard van de VOC’s, het extractieprotocol (inclusief tijd, temperatuur en zoutconcentratie), monsterstabiliteit en de beschikbaarheid van voldoende vruchtweefsel26,27. Dit artikel presenteert een protocol voor zwarte bessen VOC’s geïsoleerd door HS-SPME en geanalyseerd door gaschromatografie in combinatie met een ionenval massaspectrometer. Een evenwicht tussen de hoeveelheid plantaardig materiaal, de stabiliteit van het monster en de duur van de extractie en chromatografie werd bereikt om grote aantallen zwarte bessenmonsters te kunnen verwerken, waarvan sommige in deze studie werden gepresenteerd. In het bijzonder zullen VOC-profielen en/of chromatogrammen van vijf cultivars (‘Andega’, ‘Ben Tron’, ‘Ben Gairn’, ‘Ben Tirran’ en ‘Tihope’) als voorbeeldgegevens worden gepresenteerd en besproken. Bovendien is hetzelfde protocol met succes in de praktijk gebracht voor VOS-meting in andere fruitbessensoorten zoals aardbei (Fragaria x ananassa), framboos (Rubusidaeus) en bosbes (Vaccinium spp.).
Protocol
Representative Results
Discussion
Het veredelen van fruitaroma’s wordt al lang belemmerd door de complexe genetica en biochemie die ten grondslag liggen aan de synthese van vluchtige stoffen en het gebrek aan technologieën voor een goede fenotypering. Recente ontwikkelingen in metabolomische platforms, gecombineerd met genomische hulpmiddelen, maken het echter eindelijk mogelijk om de metabolieten te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de voorkeuren van de consument en om gewassen met een verbeterde smaak te kweken3. Hoe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación van de Universiteit van Malaga voor HS-SPME/GC-MS metingen. We erkennen de hulp van Sara Fernández-Palacios Campos bij volatiele kwantificering. We bedanken ook de consortiumleden van GoodBerry voor het leveren van het fruitmateriaal.
Materials
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ‘ omics’ approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., Antonio, C., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A., Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1284, 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
