Här visar vi hur man använder sandwichfrysningsanordningen för snabb frysning av biologiska exemplar, inklusive bakterier, jäst, odlade celler, isolerade celler, djur- och mänskliga vävnader och virus. Vi visar också hur man förbereder prover för ultrathinsektionering efter snabb frysning.
Kemisk fixering har använts för att observera ultrastrukturen i celler och vävnader. Denna metod bevarar dock inte cellernas ultrastruktur på ett tillfredsställande sätt. artefakter och extraktion av cellinnehåll observeras vanligtvis. Snabb frysning är ett bättre alternativ för bevarande av cellstruktur. Sandwichfrysning av levande jäst eller bakterier följt av frysersättning har använts för att observera cellernas utsökta naturliga ultrastruktur. Nyligen har smörgåsfrysning av glutaraldehyd-fasta odlade celler eller mänskliga vävnader också använts för att avslöja ultrastrukturen i celler och vävnader.
Dessa studier har hittills utförts med en handgjord sandwichfrysanordning, och ansökningarna till studier i andra laboratorier har begränsats. En ny sandwichfrysningsanordning har nyligen tillverkats och är nu kommersiellt tillgänglig. Det aktuella dokumentet visar hur man använder sandwichfrysningsanordningen för snabb frysning av biologiska exemplar, inklusive bakterier, jäst, odlade celler, isolerade celler, djur- och mänskliga vävnader och virus. Också visas beredningen av exemplar för ultrathin sektionering efter snabb frysning och förfaranden för frysersättning, harts inbäddning, trimning av block, skärning av ultrathin sektioner, återvinning av sektioner, färgning och täckning av galler med stödfilmer.
Elektronmikroskopi är ett kraftfullt verktyg för att studera cell ultrastruktur. Kemisk fixering med konventionella uttorkning förfaranden har använts för att observera ultrastructure av celler och vävnader. Denna metod bevarar dock inte cellernas ultrastruktur på ett tillfredsställande sätt, och artefakter och extraktion av cellinnehåll observeras vanligtvis. Snabb frysning och frysersättning av celler och vävnader är bättre alternativ för bevarande av cellstruktur.
Tre huvudmetoder har använts för frysning av celler snabbt1:1) doppfrysning utförs genom att kasta exemplar i en kyld kryogen, såsom propan, och användes sedan början av 1950-talet2; 2) Frysning av kalla metallblock utförs genom att snabbt slå celler och vävnader på ett metallblock som kyls med flytande kväve eller flytande helium3,4; och 3) högtrycksfrysning görs genom frysning av celler och vävnader med flytande kväve under högt tryck5,6,7.
Sandwichfrysning är en typ av doppfrysning som utförs genom att smöra tunna biologiska material mellan två kopparskivor och snabbt frysa dem genom att kasta sig i flytande propan8,9,10. I denna metod kyls mycket tunna exemplar (några mikrometer tjocka) snabbt med kryogen med en metall som har god värmeledningsförmåga från båda sidor. Således tar denna metod effektivt bort värme från proverna, vilket gör det möjligt att stabilt frysa celler utan iskristallskador. Sandwichfrysning, följt av frysersättning av levande jäst och bakterieceller, avslöjar den naturliga ultrastrukturen i cellerna10,11,12,13,14,15,16.
Nyligen har denna metod visat sig vara användbar för att bevara tydliga cellbilder av glutaraldehyd-fasta mikroorganismer17,18,19,20,21,22,23,24, odlade celler25,26,27och mänskliga celler och vävnader1,28 . Även om dessa studier har utförts med hjälp av en handgjord sandwichfrysanordning29, och ansökningarna till andra studier i andra laboratorier har begränsats, har en ny sandwichfrysanordning (SFD) tillverkats28 och är nu kommersiellt tillgänglig.
Det aktuella dokumentet visar hur man använder SFD för snabb frysning av biologiska exemplar, inklusive bakterier, jäst, odlade celler, isolerade celler, djur- och mänskliga vävnader och virus. Också visas beredningen av exemplar för ultrathin sektionering efter snabb frysning, liksom förfaranden för frysersättning, harts inbäddning, trimning av block, skärning av ultrathin sektioner, återvinning av sektioner, färgning och täckning av galler med stödfilmer.
Följande diskussion bygger på mer än 120 sandwich frysfrysnings-substitutionsexperiment på mer än 1 000 prover och mer än 70 dykfrysningselektronmikroskopiexperiment på mer än 75 prover som utförts under 36 år.
Framgångsgrad för god frysning genom smörgåsfrysning
Graden av framgång för att uppnå god frysning beror på proverna. Saccharomyces cerevisiae (jäst) celler odlade i YPD medium (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% dextros) gav nästan 100% framgång för god frysning utan iskristallbildning10,11,15,35,36. Andra jästarter, inklusive Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57och Trichosporon, visade också god frysning. Bakterier, inklusive Mycobacterium58,59 och E. coli16,visade också god frysning. Odlade celler och isolerade djurceller visade god frysning för både levande och glutaraldehyd-fasta celler1,25,26,27,60. Glutaraldehyd-fasta djur- och mänskliga vävnader som skivats till 0,1 till 0,2 mm tjocklek visade också god frysning för det mesta1,28.
Förhållanden för god frysning
Använd endast celler i lämpligt tillväxtstadium och tillstånd. Celler i kulturen bör vara i den exponentiella fasen. Applicera mycket små mängder cellupphängningar av koncentrerade prover (för S. cerevisiae, ~0,02 μL 3-5 × 109 celler/ml) på kopparskivan. Glutaraldehyd-fixerade skivor av djur- eller människovävnader bör också vara mycket små (helst 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). Eftersom det är svårt att skära 0,1 mm tjocka vävnadsskivor, skiva många vävnader och välj tunna och halvtransparenta skivor. Arbeta snabbt men försiktigt och låt inte proverna torka ut. När du plockar upp de staplade kopparskivorna med pincett, tryck inte på skivorna för hårt för att undvika att krossa cellerna och vävnaderna. Provbelastning är det viktigaste steget för framgångsrik frysning, och de förhållanden som krävs är desamma som förutsättningarna för god frysning för högtrycksfrysning. Läsare bör hänvisa till den utmärkta recensionen av McDonald61.
Andra applikationer
Detta dokument presenterar elektronmikrografer av en bakterie, jäst, odlade celler, isolerade djurceller, mänskliga vävnader och viruspartiklar. Vi observerade god frysning av glutaraldehyd-fasta marina alger. Cellstrukturerna hos levande sötvattengröna alger förstördes dock av iskristallbildning. Blandning av celler med 20% bovin serum albumin (BSA) säkerställde att ultrastructure var välbevarad utan is-kristall skador. Användningen av 20% BSA var också fördelaktigt för att bevara ultrastrukturen av stjälkceller av en svamp. Experiment med frysning av växtceller och vävnader genom att applicera 20% BSA pågår. Även om skanning av elektronmikroskopi av sandwich frysfrys-ersatta prover inte har försökts, har observation av välbevarade cellstrukturer rapporterats tidigare9.
Anteckningar om smörgåsfrysningsmetoden
Cellernas nära infödda ultrastruktur observeras bäst genom snabb frysning och frysersättning av levande celler. Iskristallbildning med SFD kan undvikas genom att begränsa cellernas tjocklek till ≤30 μm1. Fixering av vävnader med glutaraldehyd ger ofta bättre bevarande av cellstrukturen för observation av suspensionskulturerade celler eftersom glutaraldehydfixering gör cellstrukturen mer styv och förhindrar eventuella strukturella förändringar under insamling och centrifugering av levande celler1. Glutaraldehydfixering gör det också möjligt att förlänga frysdjupet till så mycket som 0,2 mm1, liknande det som uppnås med högtrycksfrysningsmetoden (HPF). Därför kan HPF-maskinen ersättas med SFD för djupfrysning av djur- och människovävnader.
Eftersom glutaraldehydfixerade vävnader kan lagras i mer än 2 år28kan smörgåsfrysning utföras enligt användarens bekvämlighet. Fixering av vävnader med glutaraldehyd underlättar också vävnadssektionering eftersom vävnaderna blir styvare med fixering. Till skillnad från HPF-maskinen kan SFD användas för snabb frysning av virus för kryoelektronmikroskopi och för bakterier och eukaryota celler. Jämfört med HPF-maskinen är SFD dessutom liten, bärbar, billigare och kan förvärvas av fler laboratorier. Vi hoppas att dessa funktioner i SFD hjälper fler laboratorier att uppnå sina forskningsmål28.
Egenskaper hos cellernas naturliga morfologi
Cellstrukturerna är i sitt naturliga tillstånd om de uppvisar följande utseende: Membranstrukturer i det yttre membranet (figur 12A, B),plasmamembran (figur 12B,C; Figur 13A–D; och figur 14E),kärnhölje (figur 12C,figur 13B–Doch figur 14D–E), mitokondrier(figur 12C,figur 13Coch figur 14D)och vakuoler(figur 12C)visar släta konturer. Kärnan och vakuolerna är nästan cirkulära (figur 12C). Ribosomer visar ett tydligt elektrontät utseende med en diameter på ~20 nm (figur 12B, C; Figur 13C. och figur 14D). Cytoplasman är elektron-lucent (figur 12B, C; Figur 13C. och figur 14D).
Effekten av glutaraldehydfixering på cellmorfologi
Glutaraldehyd fixering utfördes för djur eller mänskliga vävnader före smörgås frysning för att erhålla iskristallfria ultrastructure. De mikrografer som erhålls med denna metod visar utsökt tydliga bilder som liknar de som erhålls genom snabb frysning av levande vävnader (figur 14)1. Studierna på jästceller, djuphavsmikroorganismer och odlade celler visar att deformationen av ultrastruktur främst beror på osmium tetroxid fixering och uttorkning av etanol vid rumstemperatur1,17,18,28. Small rapporterade också att även om glutaraldehydfixering inte förstör organisationen av aktin i odlade fibroblaster, förstör osmium tetroxidfixering och uttorkning genom aceton eller etanol vid rumstemperatur aktinorganisation62.
Därför bör en detaljerad studie om effekterna av glutaraldehydfixering på cellmorfologi utföras. Ohno utvecklade en in vivo cryofixation metod där levande vävnader snabbt fryses utan att stoppa blodtillförseln63. Vävnaderna var frys-ersätter och inbäddas i epoxiharts, och ultrathin avsnitt observerades. Elektron mikroskopiska bilder visade närmast infödda ultrastructure av levande vävnader jämfört med de som erhållits genom kemisk fixering-konventionell uttorkning och genom snabb frysning av färska ofixerade vävnader. Därför kan det vara intressant att jämföra den ultrastruktur som erhålls genom glutaraldehyd fixering-frysning substitution (den nuvarande metoden) och de genom in vivo cryofixation-freeze substitution för att undersöka effekterna av glutaraldehyd fixering.
Hänsyn till miljön och ökad experimentell effektivitet
Vi använder 2 ml plaströr för att ersätta hartset. En ml utspädd harts är tillräckligt för varje substitutionssteg. De använda plaströren får kasseras efter varje experiment. Detta kan spara tid och ansträngning för tvättning av glasflaskor när de används för hartsersättning. Dessutom kan uranylacetatlösning användas upprepade gånger för sektionsfärgning32. Efter färgning av sektionerna kan uranylacetatlösningen sparas och återanvändas. Eftersom uranylacetat är ett radioaktivt ämne bidrar återanvändningen av den till att undvika generering av avfall och bidrar till att skydda miljön.
Plasmapolymeriserad naftalenfilm
Plasmapolymeriserad naftalenfilm är en tredimensionellt polymeriserad kolfilm tillverkad av naftalengas genom plasmapolymerisering under glödurladdning33. Filmen är motståndskraftig mot elektronbeskjutning och kemikalier, mycket ren, transparent mot elektroner och har en plan yta och amorf struktur. Således är den plasmapolymeriserade naftalenfilmen, som är kommersiellt tillgänglig, utmärkt och rekommenderas som stödfilm.
The authors have nothing to disclose.
Ingen
Sandwich Freezing Device | Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan | MW-SFD-01 | with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath |
10 mL glass vials | – | Scintillation counter vials for fixative | |
Acetone | – | ||
Osmium tetroxide | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3004 | 0.1 g |
Deep freezer | Sanyo Co. Ltd., Osaka | MDF-C8V1 | |
Copper disk | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
Slide glass | – | ||
Double-sided adhesive tape | – | ||
Single-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Feather, FAS-10 |
Double-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Feather, FA-10 |
Shredded board | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 428 | |
Tweezers | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Several pairs |
Tweezers with polystyrene foam | – | One pair | |
Glutaraldehyde | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3052 | |
Liquid nitrogen | – | ||
Propane gas | – | Cryogen | |
Ion sputter apparatus | Hitachi high technologies, Tokyo | Hitachi E102 | |
Micropipette | – | For 1 mL, 200 μL, and 2 μL | |
Microcentrifuge | Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo | Capsulefuge, PMC-060 | |
Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | – | SMZ 645 |
LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | SM-LW 61 Ji | |
Disposable plastic container | – | 50 mL and 200 mL | |
Ethane gas | – | Cryogen | |
2 mL Eppendorf tubes | – | For embedding | |
Disposable plastic syringes | – | 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL | |
Magnetic stirrer | – | ||
Epoxy resin | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 340 | Quetol 812 set |
Silicon embedding mold | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 4217 | 7 mm in diameter, 13 mm deep |
Incubater | – | For 37 °C and 60 °C | |
Trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
LED illumination for trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
Ultrasonic Trimming Blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | Ultracut S | |
Grids | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2633, 2634 | 300 mesh, 400 mesh |
0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
Perfect Loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2351 | Fot retrieving sections |
Half Tube for section staining | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this pape |
Syringe filter | Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo | DISMIC-03CP | Cellulose acetate, 0.45 μm |
Transmission electron microscope | JEOL Co. Ltd., Tokyo | JEM-1400 |