Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden
Summary
Een langdurig ex vitro 3D-organoïde kweeksysteem werd opgezet uit muizenhepatocyten. Deze organoïden kunnen worden gepasseerd en genetisch gemanipuleerd door lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering.
Abstract
De lever is het grootste orgaan bij zoogdieren. Het speelt een belangrijke rol bij glucoseopslag, eiwitsecretie, metabolisme en ontgifting. Als uitvoerder voor de meeste leverfuncties hebben primaire hepatocyten een beperkte prolifererende capaciteit. Dit vereist de oprichting van ex vivo hepatocytenexpansiemodellen voor leverfysiologisch en pathologisch onderzoek. Hier isoleerden we muriene hepatocyten door twee stappen van collagenaseperfusie en stelden we een 3D-organoïde cultuur vast als de ‘mini-lever’ om cel-celinteracties en fysieke functies samen te vatten. De organoïden bestaan uit heterogene celpopulaties waaronder voorlopers en volwassen hepatocyten. We introduceren het proces in detail om de muriene hepatocyten of foetale hepatocyten te isoleren en te kweken om organoïden te vormen binnen 2-3 weken en laten zien hoe ze te passeren door mechanisch op en neer te pipetteren. Daarnaast zullen we ook introduceren hoe de organoïden in afzonderlijke cellen kunnen worden verteerd voor lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering. De organoïden kunnen worden gebruikt voor medicijnscreening, ziektemodellering en fundamenteel leveronderzoek door leverbiologie en pathobiologie te modelleren.
Introduction
Organoïden zijn zelfgeorganiseerde, driedimensionale (3D) in vitro clusters die zelfvernieuwende stamcellen en multi-lineage gedifferentieerde cellen bevatten1,2. De organoïden van veel organen zijn vastgesteld uit pluripotente of volwassen stamcellen door goed gedefinieerde nichefactoren, waaronder de darm, de hersenen, de dikke darm, de nier, de lever, de alvleesklier, de schildklier, de maag, de huid en de long3,4,5,6,7 . De organoïden recapituleren fysieke celfuncties door ofwel ontwikkeling na te bootsen (afkomstig van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen, PSC’s) of homeostase / regeneratieprogressie (afkomstig van volwassen stamcellen, ASC’s), wat nieuwe wegen opent in ziekteonderzoek en –therapie8,9.
Als grootste orgaan bij zoogdieren is de lever vooral verantwoordelijk voor opslag, metabolisme en ontgifting. Twee soorten epitheelceltypen, hepatocyten en cholangiocyten, construeren de basiseenheid van een leverlobule. Hepatocyten zijn verantwoordelijk voor 70-80% van de leverfunctie10. Hoewel de lever een opmerkelijk regeneratievermogen heeft, gebeurt snel verlies van hepatocytenkenmerken tijdens traditionele monolaagkweek door ontregelde celpolarisatie en dedifferentiatie, waardoor de behoefte van onderzoekers en clinici om ‘gap-bridging’ levermodellen in een schaal te bouwen, toeneemt. Tot voor kort waren de ex vivo expansiemodellen van primaire hepatocyten echter niet goed vastgesteld11,12,13,14,15. Leverorganoïden kunnen worden vastgesteld uit embryonale / geïnduceerde pluripotente stamcellen, fibroblastconversie in hepatocytachtige cellen en weefsel-afgeleide cellen. De ontwikkeling van leverorganoïden stimuleert de toepassing van een in vitro model voor geneesmiddelenscreenings en levertoxiciteitstests16,17.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het vaststellen van leverorganoïden uit muriene primaire hepatocyten. Door dit protocol te gebruiken, hebben we een in vitro kweeksysteem van hepatocytenorganoïden opgezet met twee perfusies van collagenase. Deze organoïden kunnen maandenlang worden gepasseerd voor langdurige expansie. Hun fysiologische functie is zeer consistent met hepatocyten. Verder geven we ook een gedetailleerde beschrijving van hoe genetische manipulatie kan worden uitgevoerd, zoals lentivirusinfectie, siRNA-transductie en CRISPR-Cas9-engineering met behulp van organoïden. De verspreiding van hepatocytenorganoïden werpt licht op de mogelijkheid om organoïden te gebruiken om leverbiologie te begrijpen en gepersonaliseerde en translationele medische benaderingen te ontwikkelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vermogen om volwassen hepatocyten gedurende lange perioden te kweken is van fundamenteel belang bij het bestuderen van de basiswetenschap van de lever, medicijntoxicologie en hepatotrope gastheer-microbiologische infecties zoals malaria en de hepatitisvirussen. Met een goed gedefinieerde niche zet het protocol hier een kweeksysteem op voor hepatocyten. Dit protocol drijft volwassen hepatocyten om uit te breiden in 3D-cultuur met een heterogeniteit die cel-celinteractie, de meeste hepatocytenfunctie en genetische modi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken professor Hans Clevers voor het verzorgen van de cellijnen om recombinant R-spondin1 te produceren. Dit werk werd ondersteund door de subsidies van het National Key R & D-programma van China (2019YFA0111400), de National Natural Science Foundation of China (31970779) aan H.H., en de Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group van Shandong University (2020QNQT003) aan H.H.
Materials
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
