Выделение клеток первичного клапана человека для моделирования заболеваний in vitro
Summary
Этот протокол описывает коллекцию аортальных клапанов человека, извлеченных во время хирургических процедур замены аортального клапана или из трупной ткани, и последующую изоляцию, расширение и характеристику специфических для пациента эндотелиальных и интерстициальных клеток первичного клапана. Включены важные детали, касающиеся процессов, необходимых для обеспечения жизнеспособности клеток и специфичности фенотипа.
Abstract
Заболевание кальцифицированного аортального клапана (CAVD) присутствует почти у трети пожилого населения. Утолщение, жесткость и кальцификация аортального клапана вызывает стеноз аорты и способствует сердечной недостаточности и инсульту. Патогенез заболевания является многофакторным, и такие стрессы, как воспаление, ремоделирование внеклеточного матрикса, турбулентное течение, а также механическое напряжение и деформация способствуют остеогенной дифференцировке эндотелиальных и клапанных интерстициальных клеток. Однако точные инициирующие факторы, которые управляют остеогенным переходом здоровой клетки в кальцифицирующую клетку, не полностью определены. Кроме того, единственной текущей терапией для CAVD-индуцированного аортального стеноза является замена аортального клапана, при которой нативный клапан удаляется (хирургическая замена аортального клапана, SAVR) или полностью складной замещающий клапан вводится через катетер (транскатетерная замена аортального клапана, TAVR). Эти хирургические процедуры сопряжены с высокой стоимостью и сопряжены с серьезными рисками; таким образом, определение новых терапевтических мишеней для открытия лекарств является обязательным. С этой целью настоящее исследование разрабатывает рабочий процесс, в котором хирургически удаленные ткани пациентов и донорские трупные ткани используются для создания специфических для пациента первичных линий клапанных клеток для моделирования заболеваний in vitro. Этот протокол вводит использование раствора холодного хранения, обычно используемого при трансплантации органов, для уменьшения ущерба, вызванного часто длительным временем закупок между иссечением ткани и лабораторной обработкой с пользой для значительной стабилизации клеток иссеченной ткани. Результаты настоящего исследования показывают, что изолированные клетки клапана сохраняют свою пролиферативную способность и эндотелиальные и интерстициальные фенотипы в культуре в течение нескольких дней после удаления клапана у донора. Использование этих материалов позволяет собирать контрольные и CAVD-клетки, из которых устанавливаются как контрольные, так и болезнетворные клеточные линии.
Introduction
Заболевание кальцифицированного аортального клапана (CAVD) является хронической патологией, характеризующейся воспалением, фиброзом и макрокальцификацией листочков аортального клапана. Прогрессирующее ремоделирование и кальцификация листочков (так называемый склероз аорты) может привести к обструкции кровотока (аортальный стеноз), что способствует инсульту и приводит к сердечной недостаточности. В настоящее время единственным методом лечения CAVD является хирургическая или транскатетерная замена аортального клапана (SAVR и TAVR соответственно). Не существует нехирургического варианта остановить или обратить вспять прогрессирование CAVD, и без замены клапана показатели смертности приближаются к 50% в течение 2-3 лет 1,2,3. Определение основных механизмов, приводящих к этой патологии, позволит выявить потенциальные новые терапевтические подходы.
У здорового взрослого человека листочки аортального клапана имеют толщину примерно в один миллиметр, и их основная функция заключается в поддержании однонаправленного потока крови из левого желудочка4. Каждая из трех листовок состоит из слоя эндотелиальных клеток клапана (VEC), который выстилает внешнюю поверхность листка и функционирует как барьер. VEC поддерживают гомеостаз клапана, регулируя проницаемость, адгезию воспалительных клеток и паракринную сигнализацию 5,6,7. Клапанные интерстициальные клетки (VIC) составляют большинство клеток внутри створки клапана8. VIC расположены в трех отличительных слоях листовки. Эти слои известны как желудочковый, губчатый и фиброза9. Желудочек обращен к левому желудочку и содержит коллагеновые и эластиновые волокна. Средний слой, spongiosa, содержит высокое содержание протеогликанов, что обеспечивает гибкость сдвига во время сердечного цикла. Наружный слой фиброзы расположен близко к поверхности оттока на стороне аорты и богат фибриллярным коллагеном типа I и типа III, которые обеспечивают силу для поддержания коаптации во время диастолы 10,11,12. VIC находятся в состоянии покоя, однако такие факторы, как воспаление, ремоделирование внеклеточного матрикса (ECM) и механическое напряжение, могут нарушить гомеостазVIC 8,9,13,14,15,16. При потере гомеостаза VIC активируют и приобретают миофибробластоподобный фенотип, способный к пролиферации, сокращению и секреции белков, которые ремоделируют внеклеточный миллие17. Активированные VIC могут переходить в кальцифицирующие клетки, что напоминает дифференцировку мезенхимальной стволовой клетки (MSC) в остеобласт 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Кальцификация, по-видимому, инициируется в богатом коллагеном слое фиброзы от вклада как VEC, так и VIC, но расширяется и вторгается в другие слои листка8. Таким образом, ясно, что и VEC, и VIC реагируют на стимулы, чтобы повысить экспрессию остеогенных генов, однако точные события, приводящие к активации остеогенных генов, а также сложное взаимодействие между клетками и внеклеточным матриксом листка остаются неопределенными. Мышиные модели не являются идеальным источником для изучения негенетических факторов патогенеза CAVD, поскольку у мышей не развивается CAVD de novo26,27, поэтому необходимо использование первичных тканей человека и первичных клеточных линий, выделенных из этих тканей. В частности, получение этих клеток в большом количестве и хорошем качестве является обязательным, поскольку область 3D-клеточных культур и органоидного моделирования расширяется и, вероятно, станет альтернативой ex vivo человеческим моделям мышей.
Целью настоящего метода является совместное использование рабочего процесса, который создал условия для эффективной изоляции и выращивания VEC и VIC, полученных из хирургически удаленных клапанов у доноров-людей. Предыдущие исследования показали успешное выделение VEC и VIC из свиных28 и мышиных клапанов29, насколько нам известно, это первое, что описывает выделение этих клеток в тканях человека. Протокол, описанный здесь, применим к иссеченным клапанам человека и значительно обходит и улучшает повреждение, вызванное часто длительным временем закупок между иссечением тканей и лабораторной обработкой, путем введения использования раствора холодного хранения, буферного раствора, клинически используемого в трансплантации органов, который значительно стабилизирует клетки иссеченной ткани. Протокол, описанный здесь, также показывает, как определить фенотип клетки и гарантировать высокую эффективность выживания клеток при минимальном перекрестном загрязнении клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Получение контрольных и болезненных тканей от человека имеет решающее значение для моделирования заболеваний in vitro и ex vivo; однако, в то время как часто говорят о проблемах преодоления разрыва между скамьей и кроватью, обратный порядок – переход от хирургического кабинета к скамье – част?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Джейсона Доббинса за проницательное обсуждение и критическое прочтение этой рукописи. Мы хотели бы поблагодарить Центр восстановления органов и образования за их помощь и поддержку, а также поблагодарить доноров тканей и их семьи за то, что они сделали это исследование возможным. Все образцы пациентов собираются у лиц, включенных в исследования, одобренные институциональным наблюдательным советом Университета Питтсбурга в соответствии с Хельсинкской декларацией. Трупные ткани, полученные через Центр восстановления органов и образования (CORE), были одобрены Комитетом по надзору за исследованиями и клинической подготовкой с участием умерших (CORID) Университета Питтсбурга.
Некоторые фигуры созданы с помощью Biorender.com.
CSH поддерживается Национальным институтом сердца, легких и крови K22 HL117917 и R01 HL142932, Американской кардиологической ассоциацией 20IPA35260111.
Materials
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
- Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
- Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
- Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
- Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
- Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
- Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
- Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
- Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
- Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
- Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
- Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
- Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment–insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
- Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
- Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
- Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
- Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
- Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
- Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
- Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
- Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
- Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
- Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
- Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells – A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
- Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
- St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
- Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).
