in vitro疾患モデリングのためのヒト初代弁細胞の単離
Summary
このプロトコルは、外科的大動脈弁置換術中または死体組織から抽出されたヒト大動脈弁の収集、およびその後の患者特異的一次弁内皮細胞および間質細胞の分離、拡張、および特性評価について説明しています。細胞生存率と表現型特異性を確保するために必要なプロセスに関する重要な詳細が含まれています。
Abstract
石灰化大動脈弁疾患(CAVD)は、高齢者人口のほぼ3分の1に存在します。大動脈弁の肥厚、硬化、石灰化は大動脈弁狭窄を引き起こし、心不全や脳卒中の一因となります。疾患の病因は多因子であり、炎症、細胞外マトリックスリモデリング、乱流、機械的ストレスおよびひずみなどのストレスは、弁内皮細胞および弁間質細胞の骨形成分化に寄与する。ただし、健康な細胞の石灰化細胞への骨形成移行を促進する正確な開始因子は完全には定義されていません。さらに、CAVD誘発性大動脈弁狭窄症の唯一の現在の治療法は大動脈弁置換術であり、それによってネイティブ弁が除去されるか(外科的大動脈弁置換術、SAVR)、または完全に折りたたみ可能な置換弁がカテーテルを介して挿入される(経カテーテル大動脈弁置換術、TAVR)。これらの外科的処置は高額で、深刻なリスクが伴います。したがって、創薬のための新しい治療標的を特定することが不可欠です。そのために、本研究では、患者から外科的に除去された組織とドナーの死体組織を使用して、in vitro疾患モデリングのための患者固有の弁膜細胞の一次ラインを作成するワークフローを開発します。このプロトコルでは、臓器移植で一般的に利用される冷蔵ソリューションを利用して、組織切除と実験室処理の間のしばしば長い調達時間によって引き起こされる損傷を軽減し、切除された組織の細胞を大幅に安定化させるという利点をもたらします。本研究の結果は、単離された弁細胞が、ドナーからの弁除去後数日以上の培養において、それらの増殖能力および内皮および間質表現型を保持することを示している。これらの材料を使用すると、コントロール細胞とCAVD細胞の収集が可能になり、そこからコントロール細胞株と疾患細胞株の両方が確立されます。
Introduction
石灰化大動脈弁疾患(CAVD)は、大動脈弁尖の炎症、線維症、および肉眼石灰化を特徴とする慢性病理です。リーフレットの進行性のリモデリングと石灰化(大動脈硬化症と呼ばれる)は、血流の閉塞(大動脈弁狭窄症)を引き起こし、脳卒中の一因となり、心不全を引き起こす可能性があります。現在、CAVDの唯一の治療法は、外科的または経カテーテル的大動脈弁置換術(それぞれSAVRおよびTAVR)です。CAVDの進行を停止または逆転させる非外科的選択肢はなく、弁置換術を行わないと、死亡率は2〜3年以内に50%に近づきます1,2,3。この病態を駆動する根本的なメカニズムを定義することで、潜在的な新しい治療アプローチが特定されます。
健康な成人では、大動脈弁尖の厚さは約1ミリメートルであり、その主な機能は左心室4からの一方向の血流を維持することです。3つのリーフレットのそれぞれは、リーフレットの外面を裏打ちし、バリアとして機能する弁内皮細胞(VEC)の層で構成されています。VECは、透過性、炎症性細胞接着、およびパラクリンシグナル伝達を調節することにより、弁の恒常性を維持します5,6,7。弁間質細胞(VIC)は、弁尖8内の細胞の大部分を構成する。VICは、リーフレットの3つの特徴的な層に配置されています。これらの層は、心室、海綿状筋、および線維症として知られています9。心室は左心室に面しており、コラーゲンとエラスチン繊維を含んでいます。中間層である海綿状菌には、心周期中にせん断の柔軟性を提供する高いプロテオグリカン含有量が含まれています。外側の線維層は大動脈側の流出面の近くに位置し、拡張期10,11,12の間に共離力を維持する強度を提供するI型およびIII型繊維状コラーゲンが豊富です。VICは静止状態にありますが、炎症、細胞外マトリックス(ECM)のリモデリング、機械的ストレスなどの要因により、VICの恒常性が破壊される可能性があります8、9、13、14、15、16。恒常性が失われると、VICは細胞外ミリエウをリモデリングするタンパク質の増殖、収縮、分泌が可能な筋線維芽細胞様表現型を活性化して獲得します17。活性化されたVICは、間葉系幹細胞(MSC)の骨芽細胞への分化を連想させる石灰化細胞に移行することができる15、17、18、19、20、21、22、23、24、25。
石灰化は、VECとVICの両方の寄与からコラーゲンに富む線維症層で開始されるように見えますが、リーフレット8の他の層を拡大して侵入します。したがって、VECとVICの両方が骨形成遺伝子の発現をアップレギュレートする刺激に応答することは明らかですが、骨形成遺伝子の活性化を引き起こす正確なイベント、および細胞とリーフレットの細胞外マトリックスとの間の複雑な相互作用は、明確に定義されていないままです。マウスはCAVD de novo26,27を発症しないため、マウスモデルはCAVD病因の非遺伝的ドライバーを研究するための理想的な情報源ではなく、したがって、初代ヒト組織およびこれらの組織から分離された初代細胞株の使用が必要である。特に、3D細胞培養やオルガノイドモデリングの分野が拡大しており、マウスモデルに代わるex vivoヒトベースの代替となる可能性が高いため、これらの細胞を大量かつ高品質で取得することが不可欠です。
本手法の目的は、ヒトドナーから外科的に除去された弁から得られたVECおよびVICを効率的に分離および成長させるための条件を確立したワークフローを共有することである。以前の研究では、ブタ28およびマウス弁29からのVECおよびVICの分離に成功したことが示されており、我々の知る限り、これはヒト組織におけるこれらの細胞の単離を説明する最初のものである。ここで説明するプロトコルは、ヒト切除弁に適用可能であり、切除された組織の細胞を大幅に安定化させる臓器移植で臨床的に利用される緩衝液である低温保存溶液の利用を導入することにより、組織切除と実験室処理の間のしばしば長い調達時間によって引き起こされる損傷を大幅に回避および改善します。ここで説明するプロトコルは、細胞表現型を決定し、細胞交差汚染を最小限に抑えて細胞生存の高効率を保証する方法も示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒトから対照組織および疾患組織を取得することは、in vitroおよびex vivo疾患モデリングにとって重要です。しかし、ベンチとベッドサイドの間のギャップを埋めることの課題についてよく話しますが、手術室からベンチへの逆の順序は、多くの場合、同じように気が遠くなるようなギャップです。基礎科学者が一次ヒト組織標本を入手するために不可欠なのは、看護師、外科技術者、医師助?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿の洞察に満ちた議論と批判的な読書をしてくれたジェイソン・ドビンズに感謝します。臓器回復教育センターの支援と支援に感謝し、この研究を可能にしてくれた組織提供者とその家族に感謝します。すべての患者サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってピッツバーグ大学の治験審査委員会によって承認された研究に登録された個人から収集されます。臓器回復教育センター(CORE)を介して得られた死体組織は、故人が関与する研究および臨床訓練の監視のためのピッツバーグ大学委員会(CORID)によって承認されました。
Biorender.com で作成されたいくつかの図。
CSHは、National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917およびR01 HL142932、American Heart Association 20IPA35260111によってサポートされています。
Materials
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
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