Isolamento di cellule valvolari primarie umane per la modellazione di malattie in vitro
Summary
Questo protocollo descrive la raccolta di valvole aortiche umane estratte durante le procedure chirurgiche di sostituzione della valvola aortica o dal tessuto cadaverico e il successivo isolamento, espansione e caratterizzazione delle cellule endoteliali e interstiziali della valvola primaria specifiche del paziente. Sono inclusi importanti dettagli riguardanti i processi necessari per garantire la vitalità cellulare e la specificità fenotipica.
Abstract
La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD) è presente in quasi un terzo della popolazione anziana. L’ispessimento, l’irrigidimento e la calcificazione della valvola aortica provocano stenosi aortica e contribuiscono all’insufficienza cardiaca e all’ictus. La patogenesi della malattia è multifattoriale e stress come l’infiammazione, il rimodellamento della matrice extracellulare, il flusso turbolento e lo stress meccanico e la tensione contribuiscono alla differenziazione osteogenica delle cellule endoteliali e interstiziali valvolari. Tuttavia, i precisi fattori iniziali che guidano la transizione osteogenica di una cellula sana in una cellula calcificante non sono completamente definiti. Inoltre, l’unica terapia attuale per la stenosi aortica indotta da CAVD è la sostituzione della valvola aortica, in cui viene rimossa la valvola nativa (sostituzione chirurgica della valvola aortica, SAVR) o una valvola sostitutiva completamente pieghevole viene inserita tramite un catetere (sostituzione della valvola aortica transcatetere, TAVR). Queste procedure chirurgiche hanno un costo elevato e comportano gravi rischi; Pertanto, l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici per la scoperta di farmaci è imperativa. A tal fine, il presente studio sviluppa un flusso di lavoro in cui i tessuti rimossi chirurgicamente dai pazienti e i tessuti dei cadaveri dei donatori vengono utilizzati per creare linee primarie specifiche del paziente di cellule valvolari per la modellazione della malattia in vitro. Questo protocollo introduce l’utilizzo di una soluzione di conservazione a freddo, comunemente utilizzata nel trapianto di organi, per ridurre i danni causati dal tempo di approvvigionamento spesso lungo tra l’escissione tissutale e la lavorazione di laboratorio con il vantaggio di stabilizzare notevolmente le cellule del tessuto asportato. I risultati del presente studio dimostrano che le cellule valvolari isolate mantengono la loro capacità proliferativa e i fenotipi endoteliali e interstiziali in coltura fino a diversi giorni dopo la rimozione della valvola dal donatore. L’utilizzo di questi materiali consente la raccolta di cellule di controllo e CAVD, da cui vengono stabilite sia le linee cellulari di controllo che quelle di malattia.
Introduction
La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD) è una patologia cronica caratterizzata da infiammazione, fibrosi e macrocalcificazione dei lembi della valvola aortica. Il rimodellamento progressivo e la calcificazione dei foglietti (definita sclerosi aortica) possono portare all’ostruzione del flusso sanguigno (stenosi aortica) che contribuisce all’ictus e porta all’insufficienza cardiaca. Attualmente l’unico trattamento per CAVD è la sostituzione chirurgica o transcatetere della valvola aortica (SAVR e TAVR, rispettivamente). Non esiste un’opzione non chirurgica per arrestare o invertire la progressione della CAVD e, senza sostituzione valvolare, i tassi di mortalità si avvicinano al 50% entro 2-3 anni 1,2,3. La definizione dei meccanismi alla base di questa patologia identificherà potenziali nuovi approcci terapeutici.
In un adulto sano, i lembi della valvola aortica hanno uno spessore di circa un millimetro e la loro funzione principale è quella di mantenere il flusso unidirezionale di sangue dal ventricolo sinistro4. Ciascuno dei tre lembi è composto da uno strato di cellule endoteliali valvolari (VEC) che riveste la superficie esterna del foglietto e funziona come una barriera. I VEC mantengono l’omeostasi valvolare regolando la permeabilità, l’adesione delle cellule infiammatorie e la segnalazione paracrina 5,6,7. Le cellule interstiziali valvolari (VIC) comprendono la maggior parte delle cellule all’interno del foglietto valvolare8. I VIC sono disposti in tre strati distinti nel volantino. Questi strati sono noti come ventricolari, spongiosa e fibrosa9. Il ventricolo è rivolto verso il ventricolo sinistro e contiene fibre di collagene ed elastina. Lo strato intermedio, la spongiosa, contiene un alto contenuto di proteoglicano che fornisce flessibilità di taglio durante il ciclo cardiaco. Lo strato esterno di fibrosa si trova vicino alla superficie di deflusso sul lato aortico ed è ricco di collagene fibrillare di tipo I e di tipo III che fornisce forza per mantenere la coaptazione durante la diastole10,11,12. I VIC risiedono in uno stato quiescente, tuttavia, fattori come l’infiammazione, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e lo stress meccanico possono interrompere l’omeostasi VIC 8,9,13,14,15,16. Con la perdita dell’omeostasi, le VIC attivano e acquisiscono un fenotipo simile ai miofibroblasti in grado di proliferare, contrazione e secrezione di proteine che rimodellano il millieu17 extracellulare. I VIC attivati possono trasformarsi in cellule calcificanti che ricordano la differenziazione di una cellula staminale mesenchimale (MSC) in un osteoblasto 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
La calcificazione sembra iniziare nello strato di fibrosa ricco di collagene dai contributi di entrambi i VEC e VIC, ma si espande e invade gli altri strati del foglietto8. Pertanto, è chiaro che sia i VEC che i VIC rispondono agli stimoli per sovraregolare l’espressione dei geni osteogenici, tuttavia, gli eventi precisi che guidano l’attivazione dei geni osteogenici, così come la complessa interazione tra le cellule e la matrice extracellulare del foglietto, rimangono mal definiti. I modelli murini non sono una fonte ideale per studiare i driver non genetici della patogenesi della CAVD, poiché i topi non sviluppano CAVD de novo26,27, quindi è necessario l’uso di tessuti umani primari e delle linee cellulari primarie isolate da questi tessuti. In particolare, ottenere queste cellule in numero elevato e di buona qualità è imperativo, poiché il campo delle colture cellulari 3D e della modellazione organoide si sta espandendo ed è probabile che diventi un’alternativa ex vivo basata sull’uomo ai modelli murini.
Lo scopo del presente metodo è quello di condividere un flusso di lavoro che ha stabilito le condizioni per isolare e far crescere in modo efficiente VEC e VIC ottenuti da valvole rimosse chirurgicamente da donatori umani. Studi precedenti hanno dimostrato il successo dell’isolamento di VEC e VIC da valvole suine28 e murine29, a nostra conoscenza questo è il primo a descrivere l’isolamento di queste cellule nei tessuti umani. Il protocollo qui descritto è applicabile alle valvole asportate umane e aggira e migliora notevolmente il danno causato dal tempo di approvvigionamento spesso lungo tra l’escissione dei tessuti e la lavorazione di laboratorio introducendo l’utilizzo di una soluzione di conservazione a freddo, una soluzione tamponata clinicamente utilizzata nei trapianti di organi che stabilizza notevolmente le cellule del tessuto asportato. Il protocollo qui descritto mostra anche come determinare il fenotipo cellulare e garantire un’elevata efficienza della sopravvivenza cellulare con una minima contaminazione crociata cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ottenere il controllo e i tessuti della malattia dall’uomo è fondamentale per la modellizzazione della malattia in vitro ed ex vivo; Tuttavia, mentre si parla spesso delle sfide di colmare il divario tra banco e capezzale, l’ordine inverso – passando dalla suite chirurgica al banco – è spesso un divario altrettanto scoraggiante. Essenziale per uno scienziato di base per ottenere campioni di tessuto umano primario è una collaborazione con uno scienziato chirurgo investito che ha un team di infermieri, tecnici chirurgic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Jason Dobbins per la discussione perspicace e la lettura critica di questo manoscritto. Vorremmo ringraziare il Center for Organ Recovery and Education per il loro aiuto e supporto e ringraziare i donatori di tessuti e le loro famiglie per aver reso possibile questo studio. Tutti i campioni di pazienti sono raccolti da individui iscritti a studi approvati dal comitato di revisione istituzionale dell’Università di Pittsburgh in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. I tessuti cadaverici ottenuti tramite il Center for Organ Recovery and Education (CORE) sono stati approvati dal Comitato per la supervisione della ricerca e della formazione clinica che coinvolge i decedenti (CORID).
Alcune figure create con Biorender.com.
CSH è supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 e R01 HL142932, dall’American Heart Association 20IPA35260111.
Materials
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
- Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
- Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
- Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
- Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
- Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
- Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
- Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
- Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
- Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
- Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
- Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
- Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment–insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
- Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
- Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
- Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
- Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
- Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
- Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
- Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
- Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
- Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
- Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
- Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells – A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
- Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
- St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
- Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).
