Denne protokollen beskriver en ikke-invasiv metode for effektivt å identifisere S-faseceller for nedstrøms mikroskopistudier, for eksempel måling av DNA-reparasjonsproteinrekruttering ved lasermikrobestråling.
DNA-skadereparasjon opprettholder cellenes genetiske integritet i et svært reaktivt miljø. Celler kan akkumulere ulike typer DNA-skader på grunn av både endogene og eksogene kilder som metabolske aktiviteter eller UV-stråling. Uten DNA-reparasjon blir cellens genetiske kode kompromittert, undergraver strukturer og funksjoner av proteiner og potensielt forårsaker sykdom.
Å forstå den romlige dynamikken i de forskjellige DNA-reparasjonsveiene i ulike cellesyklusfaser er avgjørende innen DNA-skadereparasjon. Nåværende fluorescerende mikroskopiteknikker gir gode verktøy for å måle rekrutteringskinetikken til forskjellige reparasjonsproteiner etter DNA-skadeinduksjon. DNA-syntese i S-fasen av cellesyklusen er et særegent punkt i celle skjebne angående DNA-reparasjon. Det gir et unikt vindu for å screene hele genomet for feil. Samtidig utgjør DNA-syntesefeil også en trussel mot DNA-integritet som ikke oppstår i ikke-splittende celler. Derfor varierer DNA-reparasjonsprosessene betydelig i S-fase sammenlignet med andre faser av cellesyklusen, og disse forskjellene er dårlig forstått.
Følgende protokoll beskriver utarbeidelse av cellelinjer og måling av dynamikk av DNA-reparasjonsproteiner i S-fase på lokalt induserte DNA-skadesteder, ved hjelp av et laserskanningskonfokalt mikroskop utstyrt med en 405 nm laserlinje. Tagged PCNA (med mPlum) brukes som cellesyklusmarkør kombinert med et AcGFP-merket reparasjonsprotein av interesse (dvs. EXO1b) for å måle DNA-skaderekruttering i S-fase.
Flere DNA-reparasjonsveier har utviklet seg for å adressere de forskjellige typene DNA-lesjoner som kan oppstå i celler, som alle er sterkt regulert i både rom og tid. En av de mest sårbare periodene i cellesyklusen er S-fase, når DNA-syntese oppstår. Selv om spredning er grunnleggende for livet, gir det også en stor utfordring. Celler må sikre trofast replikasjon av deres genom for å unngå mutasjoner som skal overføres til fremtidige generasjoner. Følgelig gir spredning et terapeutisk intervensjonspunkt som har blitt brukt til utvikling av terapeutiske tilnærminger innen onkologi.
Alle de viktigste teknikkene som brukes til å studere proteinrekruttering ved DNA-lesjoner har sine styrker og begrensninger. Mikrobestråling har bedre romlig og tidsmessig oppløsning1 enn de fleste av de alternative metodene som immunfluoreserende avbildning av ioniserende strålingsindusert foci (IRIF), kromatin-immunoprecipitation (ChIP) eller biokjemisk fraksjonering. Imidlertid snører mikrobestråling robustheten til de nevnte teknikkene som kan prøve et stort antall celler samtidig.
For å undersøke DNA-reparasjon i S-fase må man kunne skille S-faseceller i en asynkron cellekulturpopulasjon. Det er mange kjente metoder for å løse dette, som involverer enten synkronisering av celler eller visualisering av de forskjellige cellesyklusfasene. Begge tilnærmingene introduserer imidlertid betydelige utfordringer og mulige gjenstander. Kjemiske synkroniseringsmetoder som er mye brukt til å berike celler i tidlig S-fase (f.eks. dobbel tymidinblokk, aphidicolin og hydroksyureabehandling) oppnår synkronisering gjennom induksjon av replikeringsstress og til slutt DNA-skade i seg selv. Dette begrenser bruken av disse metodene for å studere DNA-reparasjonsprosesser i S fase2. Synkronisering gjennom serum sult og frigjøring gjelder bare for et begrenset antall cellelinjer, i stor grad unntatt kreftcellelinjer som er mindre avhengige av vekstfaktorer for cellesyklusprogresjon sammenlignet med ikke-transformerte cellelinjer. Fluorescens Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) -systemet er et spesielt nyttig verktøy for å studere cellesyklusen, men det har en grunnleggende begrensning når man skiller mellom S- og G2 cellesyklusfaser3.
Her er det vist at bruk av fluorescerende merket PCNA som en ikke-invasiv markør for S-fase begrenser ulempene ved kjemiske cellesyklussynkroniseringsmetoder, samtidig som det gir mer spesifisitet og fleksibilitet enn FUCCI-systemet. Som en enkelt markør kan IKKE bare PCNA markere S-faseceller i en asynkron populasjon, men den kan også vise den nøyaktige utviklingen av celler i S-fase (dvs. tidlig, midt eller sen S-fase)4. Lave uttrykksnivåer av eksogene, taggede PCNA sikrer minimal interferens med både cellesyklusprogresjon og DNA-reparasjonsprosesser. Viktigst, PCNA fungerer også som en intern kontroll for riktig DNA-skadeinduksjon som det er involvert i reparasjon av flere DNA-lesjoner og rekrutteres til lokalt induserte DNA-skadesteder1,4.
Eksperimentene som presenteres her viser hvordan man måler rekrutteringsdynamikken til EXO1b i S-fase og hvordan dette påvirkes av den veletablerte PARP-hemmeren olaparib. EXO1b kjerneaktivitet er relevant for et bredt spekter av DNA-reparasjonsveier, inkludert mismatch reparasjon (MMR), nukleotid eksisjonsreparasjon (NER) og dobbeltstrenget pause (DSB) reparasjon. I S-fase spiller EXO1b en viktig rolle i homolog rekombinasjon (HR) gjennom dannelsen av 3′ ssDNA-overheng under DNA-reseksjon5. EXO1b har blitt ytterligere implisert i DNA-replikasjon med roller i sjekkpunktaktivering for å starte stallede DNA-gafler på nytt, samt primerfjerning og Okazaki fragmentmodning ved den hengende tråden under strandforskyvning i replikering5. EXO1b rekruttering til skadede DNA-nettsteder er regulert av direkte interaksjon med poly (ADP-ribose) (PAR)6,7. På grunn av de mange cellesyklusspesifikke implikasjonene av EXO1b, er det et utmerket valg for S-fasespesifikke rekrutteringsstudier ved hjelp av PCNA.
Kritiske trinn og potensiell feilsøking/modifikasjon av protokoller
Riktig vevskulturfartøy for mikrobestråling er avgjørende for å lykkes. De fleste bildesystemer med høy oppløsning er optimalisert for tykkelse på 0,17 mm dekselglass. Bruk av bildekamre med høyere eller lavere tykkelse eller de som er laget av plastpolymerer (ikke optimalisert for 405 nm avbildning), kan redusere bildekvaliteten betydelig. Når du bruker glassflater, må du sørge for at de er vevskultur behandlet for å forbedre celleadhesjonen. Hvis de ikke er vevskulturbehandlet, må disse kamrene belegges, for eksempel med poly-D-lysin før du sår cellene. Når du plating celler inn i kammeret coverglass, ideell celle tetthet er avgjørende for å unngå celle syklus uregelmessigheter og ekstra stress til cellene. Riktig termisk likevekt av mikroskopkomponentene før eksperimentering for å opprettholde en stabil temperatur er avgjørende for både å opprettholde fokuset gjennom hele tidsforløpavbildningen og er også nødvendig for å sikre en homogen DDR over tid og prøver.
Det er kritisk at cellene er i en sunn tilstand før mikrobestråling for å redusere artefaktuelle data. Hvis cellene har uregelmessig morfologi etter infeksjon/seleksjon, la cellene gå gjennom flere passasjer til morfologien blir normal igjen. Sørg alltid for at cellelinjene som brukes er fri for mykoplasmaforurensning. Blant de mange bivirkningene av mykoplasmainfeksjon forårsaker det også DNA-skade på vertscellene og kan påvirke DERES DDR-veier14,15. Den mest følsomme måten å oppdage mykoplasma i cellekulturen er gjennom PCR (versus. deteksjon med DAPI eller Hoechst).
Optimal overekspression av reparasjonsproteinet av interesse bør være sammenlignbart med endogene nivåer, men høyt nok til deteksjon. Promotoren som brukes på virale vektorer, viral titer under infeksjon, og lengden på infeksjonstiden kan alle justeres for ideelle uttrykksnivåer. For konsistente resultater isolerer du individuelle cellekloner for å sikre homogene uttrykksnivåer og normal cellemorfologi. Det anbefales å bruke vektorkonstruksjoner som ikke overekspresserer tagget PCNA på høyere enn endogene nivåer for riktig cellesyklus og DNA-reparasjonsmarkørfunksjon. Selv lave nivåer av PCNA-overekspressering er tilstrekkelig til å diskriminere S-faseceller. Retrovirale pBABE-vektorer har blitt brukt til dette formålet (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA kan merkes med monomeriske røde(f.eks. mPlum, mCherry, mRuby, etc.) eller monomeriske grønne fluorescerende proteiner (f.eks. mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, etc.) som deretter kan kombineres med en vekselvis merket POI. Overekspressering av et fluorescerende merket POI har noen begrensninger og hensyn. Fluorescerende koder kan forstyrre normal proteinfunksjon og lokalisering. Dermed må plasseringen av brikken (N eller C-terminalen) vurderes. Bruk alltid monomeriske fluorescerende proteiner, da oligomerisering av ikke-monomeriske varianter kan påvirke POI-funksjonen.
Laserinnstillingene må bestemmes for hvert bildebehandlingssystem, da mange komponenter i den optiske banen vil påvirke den faktiske effekten som leveres inn i cellene. Lasermikrobestråling kan forårsake flere typer DNA-lesjoner avhengig av eksitasjonsbølgelengden, utgangseffekten til FRAP-laseren og om noen pre-sensibiliserende midler (som Bromodeoxyuridine eller Hoechst) ble brukt. 405 nm lasere kan forårsake oksidativ DNA-skade, enkle og doble strandede pauser16,17. Ved å bruke høyere laserutgangsinnstillinger øker mengden DSBer. I denne protokollen ble pre-sensibiliseringsmetoder ikke brukt, men disse teknikkene er sterkt dekket i litteraturen og gjeninnført i diskusjonen nedenfor. Etter vår mening er den beste måten å teste om ønsket lesjon genereres ved å teste for rekruttering av kjente DNA-skadeveispesifikke gener. Rekruttering av NTHL1 eller OGG1, komponenter i BER-banen, antyder induksjon av oksidert DNA-base10,11,17,18,19, mens FBXL10 eller XRCC5 indikerer tilstedeværelsen av DSBer8,20,21. Rekruttering av XRCC1 kan indikere både tilstedeværelsen av oksiderte DNA-baser og enkeltstrengede pauser (SSB)22,23. XPC (dvs. RAD4) er en god indikator på NER som fjerner de store DNA-adducts generert av ultrafiolett lys (UV)17,24. Fordi rekruttering av eksogene proteiner kan introdusere visse uregelmessigheter, kan immunfluorescerende farging av endogene DNA-reparasjonsproteiner eller markører (som γH2A.X for dobbeltstrengede pauser) bekrefte tilstedeværelsen av spesifikke DNA-lesjoner. Alternativt kan antistoffer som er reist mot bestemte typer DNA-lesjoner også brukes. For å justere den leverte laserkraften kan både oppholdstiden og laserkraften endres.
Ved hjelp av matematisk modellering kan det utføres en detaljert kinetisk analyse som kan gi verdifull innsikt i rekrutteringsegenskapene til INTERESSE (f.eks. bidrag av flere DNA-bindende domener, følsomhet mot ulike signalhendelser, etc.). Automatisert rekrutteringsevaluering og cellesporing kan kombineres for å skape robuste arbeidsflyter 1,25.
Fordeler og begrensninger ved DNA-pre-sensibilisering
Pre-sensibilisering av DNA før mikrobestråling er et vanlig brukt verktøy for DNA-reparasjon proteinrekruttering16,17. Sensibiliserende DNA før mikrobestråling gjør det mer utsatt for DSB-er. De to vanligste metodene for DNA pre-sensibilisering er forbehandling av celler med enten Bromodeoxyuridine (BrdU) eller Hoechst fargestoff. For systemer som ikke er i stand til mikrobestråling ved høye laserkrefter, kan disse metodene være nødvendige for å indusere DNA-lesjoner som DSB-er. I tillegg, i fravær av en overført lysdetektor eller et fluorescerende signal som fremhever cellekjernen (for eksempel når du studerer rekruttering av ukodede endogene DNA-reparasjonsproteiner), fungerer Hoechst som både et pre-sensibiliserende verktøy og en fluorescerende kjerneflekk. DNA pre-sensibilisering kan imidlertid introdusere betydelige komplikasjoner. BrdU (brukt ved en endelig konsentrasjon på 10 μM) må legges til celler 24 timer (eller tid tilsvarende en full cellesyklus i cellelinjen som brukes) for å kunne innlemmes riktig i DNA og kan forårsake cellesyklusinterferens26. Hoechst 33342 (brukes ved en endelig konsentrasjon på 1 μg/ml) er cytotoksisk etter lange inkubasjonsperioder, men krever tilstrekkelig tid til å mette kjernen med fargestoffet. Derfor bør den bare påføres 15-20 minutter før mikrobestråling; Ellers vil ikke rekrutteringsdataene være konsistente. Cellene farget på denne måten kan ikke holdes i kultur i mer enn noen få timer27,28. Pass på at du ikke bruker Hoechst 33358, som ikke er så cellegjennomtrengelig som Hoechst 33342 fargestoffet. Pre-sensibilisering kan også introdusere unødvendig varians blant eksperimenter og gjør eksperimentet enda mer følsomt for forskjeller i celletetthet (da dette vil påvirke mengden innlemmet fargestoff / celle).
Fordeler og begrensninger ved konfektmikroskopi
Bildehastigheten til konfektmikroskopi kan begrenses sammenlignet med widefieldmikrokopi. Imidlertid kan et konfokalt mikroskop utstyrt med en resonansskanner forbedre bildehastigheten (på bekostning av oppløsning) som kommer nær hastighetene til spinning-diskmikroskopi. Tre funksjoner gjør A1R HD25 konfokalt system til et utmerket valg for protokollen som presenteres her. For det første gjør systemets 25 mm FOV det mulig å bilde mellom 15-20 celler i et enkelt skannet felt (vs. 5-10 celler i vanlige oppsett), noe som begrenser antall oppkjøp som er nødvendige for å få nok celler til statistisk analyse. For det andre gjør FRAP-modulen og to scanheads det mulig å avbilde og mikrobestråle cellene samtidig, ikke bare sekvensielt. Til slutt gir fleksibiliteten ved å ha både resonans- og galvanoskannere muligheten til enkelt å bytte mellom høy temporal oppløsningsavbildning med eksepsjonell hastighet som minimerer slukking av fluoroforer, og bildebehandling med høy romlig oppløsning som bruker langsommere skannehastigheter for å produsere bilder med høyere signal-til-støy-forhold. Mens det brukte systemet tillot den nevnte fleksibiliteten, å ligne mer allment tilgjengelige konfokale mikroskopkonfigurasjoner, ble bare galvano-skanneren brukt i de presenterte eksperimentene (for både mikrobestråling og påfølgende avbildning).
Fordeler og begrensninger ved mikrobestråling
Mens mikrobestråling gir uovertruffen romlig og tidsmessig oppløsning, er den ikke uten begrensninger. DNA-skade ved lasermikrobestråling er svært gruppert til bestemte deler av kjernen sammenlignet med naturlig forekommende skadelige midler. Dermed kan kromatinrespons på grunn av mikrobestråling variere sammenlignet med homogent distribuert skade. I tillegg er mikrobestråling tidkrevende og kan bare utføres på noen få dusin celler, mens store befolkningsbaserte biokjemiske metoder (kromatinfraksjonering, immunoprecipitation, ChIP) kan gi økt robusthet ved å studere tusenvis av celler om gangen. Verifisering av observasjoner gjort ved mikrobestråling med tradisjonelle biokjemiske teknikker er en effektiv strategi for pålitelige konklusjoner. Selv om samtidig mikrobestråling av mange celler i en bestemt FOV er mulig, vil bildesystemet trenge mer tid til å utføre oppgaven. Derfor begrenser måling av dynamikken i proteiner som rekrutterer veldig raskt til DNA-lesjoner antall mulige ROIer for mikrobestråling som brukes samtidig. På bildesystemet som brukes til denne protokollen, tar mikrobestrålingen av en enkelt 1024 piksler lang avkastning 1032 ms ved hjelp av 1000 μs oppholdstid og 3088 ms ved hjelp av 3000 μs dveler tid å fullføre. Bruk av flere linjer med ROIer vil øke tiden det tar å fullføre mikrobestråling betydelig (f.eks. 7 x 1024 piksler lang avkastning tar 14402 ms ved hjelp av 1000 μs oppholdstid og 21598 ms ved bruk av 3000 μs oppholdstid). Denne gangen går tapt fra bildeinnhenting og må tas i betraktning. Ved avbildning av raske rekrutteringshendelser, bruk kortest mulig avkastning og bare mikrobestråle en celle om gangen.
Fordeler og begrensninger i forhold til synkroniseringsmetoder
For cellesyklusspesifikke studier innebærer de eksisterende metodene enten synkronisering av celler i bestemte cellesyklusfaser eller bruk av fluorescerende reportere for å identifisere cellens spesifikke cellesyklusfase. Hver av disse metodene gir imidlertid sine egne utfordringer og begrensninger.
FUCCI-systemet3 (avhengig av fluorescerende proteinmerkede avkortede former for CDT1 og Geminin) er et spesielt nyttig verktøy for cellesyklusstudier, men har begrensninger når det gjelder å skille mellom S- og G2-faser av cellesyklusen. Geminin-nivåene er allerede høye fra midten av S-fasen og holder seg høye til M-fasen, noe som gjør disse fasene vanskelige å skille. Bruk av FUCCI-systemet betyr også at to optiske kanaler i mikroskopet ikke kan brukes til avbildning av POI.
Ikke-kreftcellelinjer kan synkroniseres til G0 ved fjerning av vekstfaktorer som finnes i serumet (serum sult) forårsaker liten eller ingen DNA-skade på cellene. Imidlertid vil de fleste kreftcellelinjer delvis fortsette å utvikle seg gjennom cellesyklusen selv uten tilstrekkelige mengder serum i media. I tillegg begynner celler delvis å miste synkroniseringen innen slutten av G1, tidlig S-fase. I tillegg til serum sult, er det mange kjemiske metoder for å oppnå cellesyklussynkronisering. Hydroksyurea, afidolin og tymidinblokker er metoder for å stoppe DNA-replikasjon for å synkronisere celler inn i tidlig S-fase. Selv om disse metodene er billige og enkle, introduserer de replikeringsstress som resulterer i DNA-skade. Disse DNA-replikasjonshemmerne har vist seg å indusere fosforylering av H2A. X, en velkjent markør for DSBer2,29. Metoden for å bruke tagged-PCNA som markør for S-faseceller reduserer potensialet for gjenstander forårsaket av kjemisk synkronisering og kan brukes på et bredt spekter av cellelinjer sammenlignet med serum sult.
Konklusjon
DNA-skade er en drivkraft for genetiske sykdommer der mutagene lesjoner kan føre til ondartet transformasjon av celler. Målretting mot DNA-syntesemaskineriet er en grunnleggende terapeutisk strategi i behandling av hyperproliferative sykdommer som kreft. For å behandle disse sykdommene på en mer målrettet måte, trenger vi en bedre forståelse av proteinene som reparerer DNA-lesjoner. Protokollen som beskrives her hjelper mikrobestrålingsbaserte studier i S-fase ved å minimere utfordringene ved tradisjonelle synkroniseringsmetoder for å redusere mulige gjenstander og øke reproduserbarheten til forsøkene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker M. Pagano for hans kontinuerlige støtte samt D. Simoneschi, A. Marzio og G. Tang for deres kritiske gjennomgang av manuskriptet. B. Miwatani-Minter takker R. Miwatani og B. Minter for deres fortsatte støtte. G. Rona takker K. Ronane Jurasz og G. Rona for deres fortsatte støtte.
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | For quenching formaldehyde |
Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody | Proteintech | 16253-1-AP | primary antibody |
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | primary antibody |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 3117332001 | BSA for blocking |
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Merck | 19-160 | pre-sensitizing agent |
Citifluor™ Mountant Solution AFR3 | Electron Microscopy Sciences | 17973-10 | antifade containing PBS solution for imaging |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | nucleic acid stain |
DMEM Medium | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | Cell culture medium for HEK293T cells |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehichle control and dissolution solvent |
EGFP-FBXL10 | Addgene | #126542 | viral expression vector for EGFP-FBXL10 |
EXO1b-AcGFP (in pRetroQ) | custom cloning | na | EXO1b cDNA was cloned in the NheI, BamHI sites of pRetroQ-AcGFP1-N1 vector. |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | Media supplement |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | Phenol red free medium for microscopy |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | secondary antibody |
HEK293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | Cell line for viral packaging |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | Buffering agent to supplement live cell imaging medium |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | pre-sensitizing agent |
Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection reagent |
McCoy’s 5A (Modified) Medium | Life Technologies | 16600-108 | Cell culture medium for U-2 OS cells |
mCherry-PCNA | Addgene | #55117 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
mPlum-PCNA | Addgene | #55994 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
mPlum-PCNA (in pBABE) | custom cloning | na | mPlum-PCNA cDNA was cloned from Addgene #55994 in the BamHI, SalI sites of pBABE (puro) |
Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller | Nikon | na | confocal imaging system |
Nikon LUN4 laser unit | Nikon | na | excitation system |
Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit | Nikon | na | FRAP laser unit |
Nikon NIS Elements Confocal Controller Software | Nikon | na | Confocal controlling software |
Nikon Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | na | inverted epifluorescent microscope base |
Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System | Nikon | na | illumination system |
NTHL1-mCherry (in pRetroQ) | custom cloning | na | NTHL1 cDNA was cloned in the NheI, SalI sites of pRetroQ-mCherry-N1 vector. |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well) | Thermo Fisher Scientific | 155382PK | Live cell microscopy cell culture chamber |
Olaparib | Selleck Chemicals | S1060 | PARP inhibitor |
Opti-MEM reduced serum media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Dilution medium for transient transfection |
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Thermo Fisher Scientific | 50-980-494 | Fixative |
pBABE (hygro) | Addgene | #1765 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (neo) | Addgene | #1767 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (puro) | Addgene | #1764 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (zeo) | Addgene | #1766 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
PCNA Antibody (PC10) | Santa Cruz | sc-56 | primary antibody |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Gibco | 10378016 | Media supplement |
polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Increase viral infection efficiency |
pRetroQ-AcGFP-C1 | Takara | 632506 | retroviral expression vector |
pRetroQ-AcGFP-N1 | Takara | 632505 | retroviral expression vector |
pRetroQ-mCherry-C1 | Takara | 632567 | retroviral expression vector |
pRetroQ-mCherry-N1 | Takara | 632568 | retroviral expression vector |
pUMVC | Addgene | #8449 | Viral packaging vector |
Sodium-pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | Supplement for live cell imaging medium |
Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | Dilute in PBS for cell permeabilization buffer |
Trypsin-EDTA Solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | Dilute in PBS to split cells |
U-2 OS Cells | ATCC | HTB-96 | Optimal cell line for microscopy experiments |
Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | PCR based Mycoplasma detection kit |
VSV-G | Addgene | #8454 | Viral protein envelope vector |