Denne artikkelen tar sikte på å gi en protokoll for isolering og kultur av primærkreft-assosierte fibroblaster fra en syngeneisk murine modell av trippel-negativ brystkreft og deres anvendelse for preklinisk studie av nye nanopartikler designet for å målrette svulstmikromiljøet.
Kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er) er sentrale aktører i sammenheng med tumormikromiljøet. Til tross for at de er redusert i antall sammenlignet med tumorceller, regulerer CAF-er tumorprogresjon og gir beskyttelse mot antitumorimmunitet. Nye anticancer strategier tar sikte på å ombygge tumor mikromiljøet gjennom ablasjon av pro-tumorigenic CAFs eller omprogrammering av CAFs funksjoner og deres aktiveringsstatus. En lovende tilnærming er utviklingen av nanosized leveringsmidler som er i stand til å målrette CAF-er, og dermed tillate spesifikk levering av legemidler og aktive molekyler. I denne sammenhengen kan en mobilmodell av CAFer gi et nyttig verktøy for in vitro screening og foreløpig undersøkelse av slike nanoformuleringer.
Denne studien beskriver isolasjonen og kulturen til primær-CAF-er fra den nye 4T1-murinmodellen av trippelnegative brystkreft. Magnetiske perler ble brukt i en 2-trinns separasjonsprosess for å trekke ut CAF-er fra dissosierte svulster. Immunofenotypingskontroll ble utført ved hjelp av strømningscytometri etter hver passasje for å verifisere prosessutbyttet. Isolerte CAF-er kan brukes til å studere målrettingsevnen til forskjellige nanoformuleringer designet for å takle tumormikromiljøet. Fluorescerende merket H-ferritin nanocages ble brukt som kandidat nanopartikler for å sette opp metoden. Nanopartikler, enten nakne eller konjugert med en målrettingsligand, ble analysert for binding til CAF-er. Resultatene tyder på at ex vivo utvinning av bryst CAFs kan være et nyttig system for å teste og validere nanopartikler for spesifikk målretting av tumorigeniske CAF-er.
I løpet av de siste tiårene har det blitt klart at å drepe tumorceller vanligvis ikke er tilstrekkelig til å utrydde malignitet, da tumormikromiljøet kan føre til tumorrelaps og indusere terapeutisk motstand1,2. Et nytt paradigme har da dukket opp: målretting av tumor stroma for å frata svulsten av støttende faktorer og dermed øke effekten av kjemoterapeutiske3,4,5. Spesielt er kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er) et interessant stromalt mål i mange solide svulster6,7. CAFs er en veldig heterogen gruppe celler som samhandler med kreftceller og celler i immunsystemet gjennom sekresjon av vekstfaktorer, cytokiner og kjemokiner; bygge opp og ombygge den ekstracellulære matrisen; og aktivere metastasedannelse8,9,10,11,12. Avhengig av tumortypen viser CAF-er pro-tumorogene funksjoner, mens andre undertyper av CAF-er ser ut til å ha tumor-undertrykkende funksjoner13,14. For bedre å avklare denne dikotomien er en grundig karakterisering av CAFs fra primære og metastatiske svulster viktig.
I denne sammenhengen har et fremvoksende forskningsfelt fokusert på utvikling av nanosized midler designet for å målrette og / eller ødelegge CAF-er ved å levere aktive molekyler og legemidler som er i stand til å ombygge tumormikromiljøet15,16,17,18. Flere typer nanopartikler er designet for å oppnå CAF-ablasjon av cytotoksiske legemidler, for å indusere CAF-målrettet fotodynamisk terapi, eller for å omprogrammere CAF-er ved å tilbakestille dem til en passiv tilstand eller indusere TNF-relatert apoptose indusert liganduttrykk, som induserer apoptose av nærliggende kreftceller16,19. Videre gir potensialet til mange nanopartikler å aktivt målrette spesifikke biologiske markører opphav til håpet om å velge CAF-delsett å målrette mot. Selv om dens absolutte spesifisitet for CAF fortsatt er stilt spørsmålstegn ved, er fibroblast aktiveringsprotein (FAP) et av de mest lovende målene for pro-tumorigogen stroma og utnyttes til å styre nanodrug levering, og dermed bane banen for utvikling av CAF-rettet nanotherapeutics20,21,22.
Denne artikkelen beskriver isolering av primære CAF-er fra en modell av murin brystkreft og rapporterer deres bruk i studiet av målrettingsevnen til nanopartikler konstruert for å gjenkjenne CAF-markøren, FAP. Ferritin nanocages brukes som kandidat nanosystemer for å sette opp metoden, da deres spesifisitet av levering kan formes av overflateeksponeringen av målretting av moieties23,24. Videre har ferritins vist seg å være gode biokompatible skyttelbusser for antitumorapplikasjoner, noe som utløser rask opphopning av nyttelasten i tumormassen25,26,27. Til dags dato har prekliniske studier av CAF-målrettede nanosystemer involvert in vitro-testing på fibroblastcellelinjer stimulert i kultur med transformerende vekstfaktor-beta for å indusere celleaktivering og uttrykket av noen immunofenotypiske trekk ved CAFs28,29. Denne metoden brukes vanligvis på udødelige cellelinjer (for eksempel NIH3T3, LX-2) og er ganske rask og enkel, noe som gir aktiverte celler om noen timer eller dager. En begrensning er at selv om in vitro stimulering induserer uttrykket av noen gener som tilskrives aktiverte myofibroblaster, kan den ikke helt rekapitulere alle de biologiske egenskapene til ekte CAFer, spesielt deres heterogenitet in vivo.
En annen strategi innebærer utvinning av primære CAF-er fra menneskelige eller musesvulstprøver30,31. Dette sikrer at CAF-aktivering skjer i en fysiologisk kontekst, og at heterogeniteten til CAF-delpopulasjoner opprettholdes. I henhold til forskningsmålet kan CAF-er være avledet fra forskjellige kilder, og dermed tilby muligheten til å studere den mest pålitelige tilstanden. Protokollen som rapporteres her ville være verdifull for forskere som søker å utføre en foreløpig evaluering av funksjonaliteten til nye nanopartikler designet for å målrette CAF-er fra en murin brystkreftmodell. Isolerte CAF-er vil være nyttige for screening av de nanopartiklene som er lovende nok til å fortsette med in vivo-evaluering i dyremodeller av kreft. Dette vil være relevant i løpet av de første trinnene i nanopartikkelproduksjon, drive nanoteknologiske stoffer mot raffinement av nanopartikkeldesign ved hovedsakelig å vurdere strategien for ligand immobilisering for å oppnå optimale målrettingsegenskaper.
CAF-er dukker opp som nøkkelaktører i ombygging av ekstracellulær matrise, fremmer metastaseprogresjon og begrenser narkotikatilgangen til tumorstedet34. På grunn av deres heterogenitet er deres roller fortsatt kontroversielle – noen CAF-er er tumorigene, mens noen andre undertyper ser ut til å ha en tumor-undertrykkende rolle. I denne sammenhengen kan isolasjonen være av ekstrem interesse for å belyse deres mye omdiskuterte rolle i kreftprogresjon, noe som vil ha viktige kliniske implikasjoner12,31. Videre vil vellykket CAF-ekstraksjon fra menneskelige og prekliniske musesvulstmodeller også lette utviklingen av nye CAF-målrettede legemidler. Denne artikkelen rapporterer en metode for effektivt å isolere og dyrke primære CAF-er fra en preklinisk modell av brystkreft. Basert på erfaring påvirker tre eksperimentelle trinn for det meste suksessen til protokollen.
Den første jobber raskt for å unngå aggregering av cellesuspensjoner knyttet til risikoen for koagulering i kolonnen og bremse celleutløp: Faktisk, når celler som passerte gjennom kolonnen ble gruppert sammen, økte sannsynligheten for en sub-optimal isolasjonsprosess, og de endelige kulturene inneholdt “forurensning” cellekloner. Den andre er å samle celler fra forskjellige svulster etter uttømmingspassasjen for å garantere at nok celler skal passeres gjennom i det endelige berikelsestrinnet. Det endelige kritiske problemet er å plating de ekstraherte cellene ved høye celletettheter, mest sannsynlig fra en enkelt brønn av 24-brønnsplaten for å øke celleveksten og koloniutvidelsen i opptil 4-5 passasjer. Hvis cellene ble sådd ved lave tettheter, utvidet de seg på den frie overflaten og sluttet raskt å replikere.
Flere studier har allerede beskrevet CAF-ekstraksjonsmetoder av både menneskelig og mus opprinnelse, for å studere deres rolle i å fremme kreftutvikling og invasivitet. Dette har blitt gjort i mange typer svulster, inkludert brystkreft, melanom, cholangiokarsinom og bukspyttkjertel adenokarsinom35,36,37,38. På grunn av mangel på spesifikke CAF-markører og deres heterogenitet er resultatene av disse prosessene fortsatt under-optimale.
Her ble de isolerte cellene brukt til å validere CAF-målrettingsevnen til HFn nanocages funksjonalisert med anti-FAP-målrettingsmoieties. Bruken av primære kulturer av CAF-er var en betydelig fordel, slik at valideringen av nanostrategy ex vivo med et mye enklere og kostnadseffektivt bindingseksperiment enn å gjøre det direkte in vivo i denne foreløpige fasen av nanodrugoptimalisering.
I denne forstand kan ex vivo-testing på CAF-er gå foran in vivo-dyreforsøk ved å tillate screening og valg av de mest lovende nanopartiklene for optimal målretting av CAF. CAF-modellen som presenteres her kan også brukes til foreløpige effektstudier, ved lasting av nanopartikler med aktive legemidler. Dyr vil først bli brukt senere for å evaluere biodistribusjon, farmakokinetikk og effektstudier.
Flere CAF-målrettede nanodrugs utvikles, for eksempel ferritin nanocages for fotodynamisk terapi i brystkreft og peptidbaserte partikler for å levere doksorubicin i prostatakreftmodeller39,40. Imidlertid har ikke mange studier fokusert på isolering av CAF-er som celleplattformer for nanodrugoptimalisering.
Denne protokollen har noen begrensninger. For det første er det en tidkrevende protokoll som krever forberedelse og kjøp av flere reagenser og materialer. For det andre, på grunn av knappheten på CAF-er i 4T1 brystsvulsten, er utbyttet lavt. Nanopartikkelforsøk bør planlegges og utføres så snart det nødvendige cellenummeret er oppnådd, da primære CAFer gjennomgår senescence og ikke kan opprettholdes i kulturen i lang tid. Til slutt kan denne metoden for CAFs isolasjon, kultivering og karakterisering være et kraftig verktøy for å akselerere utviklingen av nye målrettede nanomedisiner i kampen mot kreft.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) under IG 2017-ID. 20172 prosjekt – P.I. Corsi Fabio. SM anerkjenner Pediatric Clinical Research Center “Romeo and Enrica Invernizzi” som støtter hennes posisjon. AB takker AIRC (ID. 20172 prosjekt) og University of Milan for stipendiatstilling. LS og MS postdoktor- og doktorgradsstipend støttes av Universitetet i Milano.
ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at – 20 °C. |
Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |