Baculovirus expression vector system (BEVS) er en robust plattform for expression screening og produksjon av protein arginin metyltransferaser (PRMTs) som skal brukes til biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier. Milligram mengder materiale kan produseres for de fleste PRMTs og andre proteiner av interesse som krever en eukaryotisk uttrykksplattform.
Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på et bredt utvalg av proteiner som spiller roller i mange cellulære prosesser. PRMTs kan enten mono- eller dimetylat arginin guanidino grupper symmetrisk eller asymmetrisk. Enzymologien til disse proteinene er et komplekst og intenst undersøkt område som krever milligram mengder rekombinant protein av høy kvalitet. Baculovirus expression vector system (BEVS) som bruker Autographa californica flere nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) og Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insektceller har blitt brukt til expression screening og produksjon av mange PRMTs, inkludert PRMT 1, 2 og 4 til 9. For samtidig å screene for uttrykk for flere konstruksjoner av disse proteinene, inkludert domener og avkortede fragmenter samt proteiner i full lengde, har vi brukt skalerbare metoder ved hjelp av justerbare og programmerbare flerkanals pipetter, kombinert med 24- og 96-brønnsplater og blokker. Samlet sett gjorde disse metodejusteringene det mulig med en storskala generasjon bacmid-DNA, rekombinante virus og screening av proteinuttrykk. Bruk av kulturfartøy med et høyt fyllvolum av Sf9 cellefjæring bidro til å overvinne plassbegrensninger i produksjonsrørledningen for enkelt batch storskala proteinproduksjon. Her beskriver vi detaljerte protokoller for effektivt og kostnadseffektivt uttrykk for funksjonelle PRMTer for biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier.
Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på en monometyl- eller symmetrisk/asymmetrisk dimetylmote. De repeterende RG / RGG / GRG-sekvensene er svært foretrukket av de fleste PRMTs og finnes i et bredt utvalg av proteiner1,2. Arginin metylerte proteiner som histoner eller transkripsjonsfaktorer og skjøtefaktorer regulerer transkripsjon, skjøting og kromatinstruktur3,4. Økende kunnskap om mangfoldig regulering av substrat- og kofaktorutnyttelse, omsetning og kinetikk av PRMTs, samt generering av selektive inhibitorer, har kastet mekanistisk lys over disse enzymene og deres komplekser5,6. Imidlertid studeres ikke alle PRMT-familiemedlemmer i samme grad; PRMT9 ble for eksempel bare nylig oppdaget å være medlem av PRMT-familien1. Struktur- og enzymfunksjonsstudier for disse proteinene krever tilstrekkelig, ofte milligram, mengder rekombinant protein for å være tilgjengelig.
Escherichia coli (E. coli) prokaryotisk uttrykkssystem er vanligvis førstevalget for expression screening ved hjelp av flere konstruksjoner for et gitt protein7,8,9. E. coli-basertuttrykk resulterer imidlertid ikke alltid i tilstrekkelige mengder PRMT-proteiner i deres aktive former, som vi spesielt har nevnt for PRMT5 og PRMT7 (se nedenfor). Dermed ble PRMTs som ikke klarte å uttrykke seg i E. coli eller måtte produseres av eukaryotic expression machinery subcloned i vektorer som passer for uttrykket screening i det alternative baculovirus expression vector system (BEVS). Mens E. coli uttrykte prøver av PRMT1, PRMT3 og PRMT8 har blitt brukt mye for in vitro-analyser og krystallografi, har andre PRMT-er som PRMT5, som krever MEP50 bindende partner for sitt doble metyltransferasedomene, og PRMTs som PRMT7 og 9, nødvendiggjøre insektcelleuttrykk for å oppnå tilstrekkelige mengder aktivt protein. Totalt sett har standardisert medium-gjennomstrømning metyltransferaseanalyser for PRMT4, 5, 6, 7 og 9 brukt BEVS i insektceller6. Baculovirus expression vector system (BEVS) er en allsidig plattform for å produsere rekombinante proteiner som krever eukaryotisk uttrykk maskineri som muliggjør post-translasjonelle modifikasjoner avgjørende for biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier10,11,12. Flere BEVSs har blitt kommersielt tilgjengelige siden den første rapporterte bruken av baculovirus i 1983 for proteinuttrykk13. De fleste av disse protokollene bruker forskjellige strategier for overføring av uttrykket plasmid til insektceller. Disse inkluderer Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Vår protokoll er basert på det mest brukte systemet i BEVS, Bac-to-Bac-systemet14, som er designet for å overføre genet / cDNA-kodingen av proteinet av interesse (POI, her PRMTs) til baculovirusgenomet opprettholdt i en spesialisert stamme av E. coli via stedsspesifikk transposisjon15.
Kort sagt ble den plasmidoverføringsvektoren som inneholder genet av interesse forvandlet til DH10Bac E. coli kompetente celler for å generere rekombinant viral bacmid DNA. Adherent Sf9 celler ble deretter transfektert med bacmid DNA. Fire til fem dager etter transfeksjon ble de første rekombinante baculovirusene utskilt i cellekulturmediet gjenopprettet og merket som P1-viruset. P1-bakulovirusbestandene ble deretter brukt til virusforsterkning (dvs. generering av P2-bakulovirusbestander) og proteinuttrykksscreening. Basert på resultatene fra uttrykksscreening ble P2-virus for den beste uttrykkskonstruksjonen av proteinet identifisert og brukt til å generere suspensjonskulturer av baculovirusinfiserte insektceller (SCBIIS) for den store proteinproduksjonen. Her beskriver vi våre detaljerte protokoller og beskriver begrunnelsen bak våre reagens- og kulturfartøyvalg for å støtte vår strategi om å utvikle en mer tidseffektiv, kostnadseffektiv og skalerbar metodikk for å oppnå tilstrekkelige mengder ønskede rekombinante proteiner.
En av fordelene med BEVS i insektceller sentrerer seg om evnen til postoversettelsesmodifikasjonsmaskineriet for å muliggjøre mer komplekse modifikasjoner som fosforylering, myristoylering og glykosylering. Sammen med den svært effektive foldingen av pattedyrproteiner, letter disse modifikasjonene høye mengder modifisert og brettet protein egnet for fysiologisk relevante nedstrømseksperimenter16.
Her beskrev vi detaljerte protokoller fra BEVS med vekt på kritiske elementer for vellykket uttrykksscreening av flere konstruksjoner av PRMT-proteiner og storskala PRMT-proteinproduksjon i Baculovirusuttrykksplattformen: 1) Bruk av vanlige, justerbare og programmerbare flerkanalspipetter for å overføre de biologiske materialene mellom 24- og 96 – brønncellekulturplater og blokker på stadier av bacmid DNA og virusgenerering; en samling av rekombinante virus, forsterkning av virusvolumer av rekombinante virus og fremstilling av proteinuttrykksscreeningsblokkene. 2) Høy ytelse og kostnadseffektive transfeksjonsreagenser for generering av rekombinante virus. 3) Suspensjon kultur av baculovirus-infiserte insektceller (SCBIIC) for storskala proteinproduksjon. 4) Utnyttelse av høyt fyllvolum 2,8 L Fernbach risteflasker for å opprettholde Sf9 suspensjon kultur og 2,5 L Tunair shake kolber og 5 L reagensflasker for storskala protein produksjon.
Spesielle hensyn og begrunnelse for transformasjons- og transfeksjonstrinnene.
Selv om en kommersiell protokoll anbefaler å bruke 100 μL kompetente celler for en transformasjon14, er transformasjonseffektiviteten til kommersielle DH10Bac E. coli kompetente celler så høyt som 1 x 108 cfu / μg DNA, så vi bruker bare 4 μL. Dette er nok for hver transformant å oppnå isolerte hvite rekombinante kolonier for bacmid DNA-isolasjon. Adherent Sf9-celler i 24-brønns transfeksjonsplaten ble sådd med en celletetthet på 2 x 105 / ml i 0,5 ml serumfrie insektmedier. Dette volumet er nok til å sikre jevn dekning av brønnens arbeidsflate. Samtidig fortynner det ikke transfeksjonsblandingen for mye, noe som forbedrer transfeksjonseffektiviteten. Transfeksjonsreagenser er ikke giftige for Sf9-cellene, og medieutveksling er ikke nødvendig. I stedet for en medieendring legges ytterligere 1,5 ml medier som inneholder 10% (v / v) FBS til transfeksjonsplaten etter 4-5 timer etter transfeksjonstid for å lette celleveksten. Transfeksjonseffektiviteten til begge transfeksjonsreagensene er høy. Likevel, med X-tremeGene 9, vises tegn på infeksjon i de transfekterte cellene (figur 2) 10-12 timer tidligere enn med JetPrime-reagenset, så vi velger mellom disse reagensene avhengig av arbeidsplanen for de neste trinnene i protokollene, noe som gir litt fleksibilitet i den generelle prosessen.
Screening av proteintestuttrykk kan settes opp med P2-virus hvis mengden av de første rekombinante virusene, samlet inn fra transfeksjonsplaten og merket som P1, er en begrensende faktor å bruke til proteinuttrykksscreening.
Hensyn ved flytting fra små til store kulturvolumer.
Historisk ble det antatt at optimal cellevekst krever et høyt luftrom i suspensjonskulturen for Sf9-cellevedlikehold og oppskaleringsproduksjoner. I 2014 ble det imidlertid rapportert at høyt luftrom i kulturfartøy er mindre kritisk enn tidligere antatt17. Et kulturfartøy satt opp ved hjelp av riktig justert ristehastighet til risteplattformens banekast vil gi tilstrekkelig oksygenoverføring selv i høyfyllvolumfjæringskulturen ved å skape og opprettholde små luftbobler i lengre tid. Med denne tilnærmingen kan kommersielt tilgjengelige insektceller dyrkes med høyere ristehastighet innenfor et normalt område av cellenes doblingstid uten å ofre høy celle levedyktighet.
For 6 år siden begynte vi derfor å øke fjæringskulturvolumet i en ristende kolbe under cellevedlikehold og introduserte en annen type kulturfartøy for proteinproduksjon mens vi justerte og overvåket risteforholdene (Figur 6). For å etablere optimale forhold i disse kulturfartøyene overvåket vi Sf9-cellekulturparametrene som celledoblingstid sammen med celle levedyktighet, størrelse og form, aggregeringstilstand og infektivitet av celler.
For eksempel, for Sf9 cellevedlikehold, i 2,8 L Fernbach riste kolber, kulturer vi 2 L i stedet for 0,8 L av Sf9-suspensjonscellene som rister ved 150 rpm ved 27 ° C og celle levedyktighet mesteparten av tiden er nær 99%, med jevnt formede sunne skilleceller. For oppskaleringsproduksjon infiserer vi 4 L celler i 5 L reagensflasker som rister i høy hastighet som 145 o/min ved en senket temperatur på 25 °C. De mest brukte inkubatorene med en innebygd risteplattform kan holde 6 x 2,8 L risteflasker eller 6 x 5 L reagensflasker, eller 10 x 2,5 L Tunair shakeflasker. Dermed er kapasiteten til den ene risteplattformen, hvis vi fyller Fernbach risteflasker og reagensflasker til 1/3 versus det høyefyllingsvolumet på fartøyene, 4,8 L versus 12 L ved hjelp av 2,8 L Fernbach risteflasker og 10 L versus 24 L ved hjelp av 5 L reagensflasker (Figur 6). Vedlikehold av suspensjonscellekultur og oppskalering av produksjonen i kulturfartøyene med høyt fyllingsvolum har hjulpet oss med å overvinne begrensninger i produksjonsvolumene og ta i bruk en storskala plattform. Dermed er dette svært nyttig for laboratorier uten tilgang til bioreaktorer og / eller begrenset plass i produksjonsrørledningene.
Denne protokollen kan enkelt tilpasses for produksjon og rensing av proteinkonstruksjoner med forskjellige affinitetskoder ved å bruke passende harpikser og modifisere rensebuffere som beskrevet i SGC-publisert papir6 for flaggmerkede proteiner i full lengde av PRMT4, 7, 9 og det His-tagged PRMT5-MEP50-komplekset og PRMT6. Selv om vi beskriver en BEVS-protokoll for PRMT-familien av proteiner, kan den samme tilnærmingen brukes på enhver annen proteinfamilie.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Dalia Barsyte-Lovejoy for å ha tatt seg tid til å gi verdifulle tilbakemeldinger og kritiske kommentarer til manuskriptet og alle våre SGC-kolleger som jobbet med PRMT-proteinfamilien uttrykt fra Baculovirus Expression Vector System.
SGC er en registrert veldedighetsorganisasjon (nummer 1097737) som mottar midler fra AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada gjennom Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU og EFPIA gjennom Innovative Medicines Initiative 2 Joint Foretak [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (aka EMD i Canada og USA), Pfizer, Takeda og Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
Beckman JLA 8.1000 | |||
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |