Modificações do Método Langendorff para Isolamento Simultâneo de Miócitos Atrial e Ventricular de Camundongos Adultos

Summary

Este protocolo descreve modificações do método Langendorff, incluindo a profundidade da cannulação de aorta para isolamento simultâneo de miócitos atrial e ventricular de camundongos adultos.

Abstract

Um único cardiomiócito é uma ferramenta vital nos estudos de nível celular e subcelular de biologia cardíaca e doenças como uma unidade fundamental de contração e atividade elétrica. Assim, isolar cardiomiócitos viáveis e de alta qualidade do coração é o passo experimental inicial e mais crucial. Comparando os vários protocolos para isolar os cardiomiócitos de camundongos adultos, a perfusão retrógrada langendorff é o método mais bem sucedido e reprodutível relatado na literatura, especialmente para isolar miócitos ventriculares. No entanto, isolar miócitos atrial de qualidade do coração perfusado permanece desafiador, e poucos relatórios de isolamento bem-sucedidos estão disponíveis. Resolver esse problema complicado é extremamente importante porque, além da doença ventricular, a doença atrial é responsável por grande parte das doenças cardíacas. Portanto, novas investigações no nível celular para revelar os mecanismos são justificadas. Neste artigo, um protocolo baseado no método de perfusão retrógrada langendorff é introduzido e algumas modificações na profundidade da cannulação de aorta e as etapas que podem afetar o processo de digestão para isolar miócitos atrial e ventricular foram feitas simultaneamente. Além disso, os cardiomiócitos isolados são confirmados como favoráveis à investigação do grampo.

Introduction

A doença cardíaca é uma das principais causas globais de ^mortalidade1. Para enfrentar esse fardo no sistema de saúde, é essencial uma compreensão aprofundada da fisiologia e patologia do coração. Além de preparação animal inteira e coração intacto, a preparação celular é outra ferramenta indispensável para o estudo funcional e da ^doença2. Aplicando o grampo de remendo, imagem de cálcio, biologia molecular e outras tecnologias avançadas, os pesquisadores podem obter mais informações sobre as propriedades eletrofisiológicas, homeostase de cálcio, caminhos de sinalização, estados metabólicos e transcrições genéticas em um único cardiomiócito (CM). Isso é extremamente útil na revelação dos mecanismos fisiológicos e patológicos do processo da doença cardíaca3,4,5,6,7. Para pesquisas em animais, podem ser utilizadas espécies que vão desde animais pequenos (por exemplo, ratos, ratos e cobaias) até animais grandes (por exemplo, coelhos e cães). Animais pequenos são geralmente preferidos, particularmente camundongos, porque são favoráveis à manipulação genética e modelo de ^{doenças8,9,10}.

As técnicas de CMs isoladas agudamente passaram por um longo período de desenvolvimento e ainda estão ^evoluindo11. A perfusão retrógrada de Langendorff é o método de isolamento de CMs mais bem sucedido e reprodutível aplicado em ratos e camundongos, especialmente para isolar miócitos ventriculares (VMs)12,13,14,15. No entanto, os relatos de miócitos atrial isolados com sucesso (AMs) são escassos16,17,18. Investigações adicionais sobre ambos os níveis de todo o órgão/sistema e o celular/subcelular para revelar os mecanismos e explorar novas abordagens terapêuticas são justificadas porque a fibrilação atrial (AF), o tipo mais comum de arritmia, está se tornando cada vez mais prevalente globalmente, e as modalidades de tratamento atuais em ambas as terapias farmacológicas e ablação cardíaca permanecem ineficazes em aproximadamente 40%-50% dos pacientes com ^AF19 . O isolamento bem-sucedido de CMs de camundongos adultos é o primeiro passo para o estudo celular. Dois métodos primários de isolamento podem ser usados: os métodos de chunk e Langendorff. No método de perfusão de Langendorff, a digestão tecidual depende da solução enzimátil fornecida pelas artérias coronárias e seus ramos para os leitos capilares. Uma profundidade de cannulação de aorta adequada que pode evitar penetrar as válvulas aórticas e bloquear a ostia da artéria coronária é o pré-requisito para alcançar tal padrão de perfusão, que também é o passo essencial para uma digestão eficiente e o rendimento ideal de VM. Portanto, é razoável supor que a profundidade da cannulação de aorta pode afetar da mesma forma a perfusão do vaso atria e, finalmente, afetar o rendimento am. Para testar essa hipótese, foi realizada a cannulação de aorta em diferentes profundidades e comparadas as seguintes rendimentos am. Os dados mostraram que a profundidade da cannulação da aorta é diretamente relevante para o rendimento do AM. Aqui, um protocolo para isolar AMs e VMs simultaneamente é introduzido.

Protocol

Camundongos adultos C57BL/6 pesando 20-30 g, 8-10 semanas de idade foram comprados no Centro Animal da Universidade Médica da Capital, Pequim, China. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Capital e foram realizados em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais laboratoriais proposto pelo Instituto de Recursos Animais e publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde. Excel e Origin 8.5 foram utilizados para aquisição e análise de dados. Os dados são apresentados como meios ± SD, para avaliação estatística, foi utilizado teste t do aluno e P < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. 1. Preparação de aparelhos de solução e perfusão Montar um aparelho Langendorff de fluxo constante (comercialmente disponível ou auto-fabricado). A Figura 1 fornece um esquema simples. Prepare as soluções de acordo com os reagentes apresentados na Tabela 1 e Tabela 2. Ligue o banho de água circulante e ajuste uma temperatura de entrada adequada (42,7 °C em nosso laboratório) para garantir que o fluxo de saída do sistema de circulação perfusada da cânula atinja 37 °C. Limpe o sistema de perfusão circulando água desionizada. Se for necessária uma condição estéril, passe 75% de etanol através do sistema de perfusão por 15 minutos, seguido de água deionizada (pelo menos 10 ciclos para evitar efeitos de toxicidade alcoólica no coração). Meça o tempo e o volume de um ciclo do sistema de circulação perfusado para determinar quantos mililitros da solução de Tyrode oxigenada devem ser carregados na etapa seguinte de perfusão. Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas no método desejado. Defina a taxa de fluxo do sistema de perfusão perfusada em 4 mL/min. Prepare duas placas de Petri limpas de 35 mm contendo a solução de Tyrode (placa de Petri 1), a outra contendo solução 1 (placa de Petri 2). Prepare uma seringa de 1 mL recheada com solução 1 e uma agulha de cânula de aço sem corte de 20 G com um entalhe de onde a distância é de 1 mm até a ponta. Prepare um nó solto com sutura 3-0 no eixo da cânula. Regular o campo de visualização do estereómico e garantir que a ponta da cânula esteja abaixo da superfície líquida da placa petri 2. 2. Preparação animal Administre heparina (concentração, 1.000 UI/mL; 0,2 mL/rato) intraperitoneally aos camundongos para evitar coágulos sanguíneos. Após 10 min, anestesia os camundongos com pentobarbital de sódio (50 mg/kg, injeção de I.P.) e certifique-se de que os ratos parem de responder a pitadas de cauda/dedo do pé. Realizar deslocamento cervical 20 min após a administração da heparina. Transfira os ratos para a plataforma cirúrgica, fixe os ratos em uma posição supina, esterilize o peito com 75% de etanol e seque-o com gaze ou guardanapo. 3. Excisão cardíaca e cannulação de aorta Levante a pele do xifoide com fórceps teciduais e faça uma pequena incisão lateral através da pele com tesoura de tecido. Realize uma dissecção contundente entre a pele e a fáscia e estenda a incisão da pele em forma de V em direção à axila em ambos os lados. Continue o mesmo traço de incisão através da caixa torácica, e então, desvie a caixa torácica para cima, apertando o esterno com fórceps teciduais para expor totalmente o coração e os pulmões. Retire o pericárdio usando um fórceps curvo. Rasgue a glândula timo em direção a ambos os lados por dois fórceps curvos se cobrir os grandes vasos. Puxe suavemente a base do coração em direção à cauda com fórceps curvas até que um vaso sanguíneo em forma de “Y” (a aorta e suas artérias ramificadas) possa ser visto. Para reservar diferentes comprimentos da aorta para cannulação e comparação, transecte a aorta na artéria carótida comum esquerda (linha verde na Figura 2) e corte a artéria braquiocefálica ao mesmo tempo em alguns camundongos. Transect na aorta ascendente em outros camundongos (linha preta na Figura 2).NOTA: Para aqueles que são novos neste procedimento, esta etapa também pode ser feita sob um microscópio estereoscópico. Extirja o coração, e imerja imediatamente na placa de Petri 1 para lavar e bombear o sangue residual. Transfira o coração para a placa de Petri 2, e corte qualquer tecido excedente usando uma tesoura de íris fina, se necessário. Para aqueles que são novos neste procedimento, faça esta etapa sob o estereótipo para evitar cortar erroneamente a aorta ou outras estruturas cardíacas. Empurre a seringa para expelir bolhas de ar antes da cannulação da aorta. Realize a cannulação de aorta retrógrada com a assistência de duas fórceps de amarração reta (mandíbulas lisas) sob o estereómicrocópio. Certifique-se de que todo o processo de cannulação esteja sob a superfície líquida. Evite penetrar as válvulas aórticas e ajuste as profundidades à aorta ascendente (o rato que a aorta foi transectada na artéria carótida comum esquerda) e a raiz aórtica (o rato que a aorta foi transectada na aorta ascendente), respectivamente.NOTA: A profundidade da canulação de aorta (conhecida apenas como profundidade) é definida aqui como a posição onde a ponta da cânula está na aorta ou onde a aorta está ligada. Ligate a aorta com a sutura pré-nó 3-0 para o entalhe de cânula. Pressione suavemente o teor de seringa para enxaguar o sangue residual.NOTA: O sangue deixará as artérias coronárias e o efusão das veias dorsais se a profundidade estiver devidamente posicionada. O coração e os apêndices atrial se expandirão e ficarão pálidos. Remova e conecte a cânula ao aparelho Langendorff. Mais uma vez, tome cuidado para evitar que bolhas de ar entrem no coração.NOTA: Esteja ciente de que o tempo da toracotomia à perfusão inicial não deve exceder 5 min. 4. Perfusão cardíaca Primeiro, a solução de Tyrode oxigenada prime e perfuse para aproximadamente 10 s (o volume de líquido rodando 10 s no sistema utilizado neste protocolo é de aproximadamente 0,7 mL) se houver sangue residual no atria, e depois mudar para a solução 1. No entanto, basta perfuse com solução 1 Se não houver sangue residual no atria. Perfunda o coração por aproximadamente 2 minutos. Mude para a solução 3. Chupe cerca de 2,5 mL de solução 3 com um tubo de polietileno estéril de uso único e pré-aquecimento no banho de água para uso posterior, com o restante usado para perfusão por aproximadamente 11-12 min. Solução de descarte 3 perfumada nos primeiros 2 minutos. Recicle o resto para os reservatórios perfusados pela bomba peristáltica para reutilização até que a digestão seja concluída. Termine a digestão quando o coração ficar inchado e ficar ligeiramente pálido e flácido (textura esponjosa) ou existe uma impressão se o miocárdio for gentilmente beliscado usando um fórceps dentuça. 5. Isolamento celular e reintrodução de cálcio Retire os ventrículos e a átrida com fórceps, e coloque-os em diferentes pratos de Petri. Adicione a solução pré-armada 3 às placas de Petri. Triturar o tecido em uma textura turva com fórceps sem cortes e gentilmente pipeta o tecido para uma digestão uniforme. Evite introduzir bolhas de ar. Transfira o tecido digerido de urbo com a pipeta para a solução 4 para prender a atividade enzimásta restante e, em seguida, centrífuga para 20 s a 192×g. Remova o supernasce e adicione a solução 5 no sedimento celular e pipeta para dispersar uniformemente as células. Reintroduzir o cálcio de forma gradual, a fim de evitar o paradoxo do cálcio e a sobrecarga de cálcio. Adicione gradualmente um total de 50 μL 100 mM/L CaCl2 (a cada intervalo de 5 minutos de 5 μL, 10 μL, 15 μL e 20 μL, respectivamente) à suspensão da célula. 6. Armazenamento de células Para o estudo do grampo de remendo, armazene as células na solução de Tyrode. Para outros estudos celulares, armazene as células na solução 6. Para garantir a precisão dos resultados dos estudos funcionais agudos (por exemplo, faíscas ca2+ , ondas ca2+ , liberação ca2+ , vazamento de Ca2+ e gravações de grampos de correção), termine esses tipos de experimentos funcionais nas próximas 6 horas.

Representative Results

Este papel, onde a ponta da cânula está posicionada na aorta, que é definida como a profundidade da cannulação de aorta (referida simplesmente como profundidade), também representa onde a aorta é ligada. O AM e vm isolados de um coração que foi cânulado e ligado na aorta ascendente são representados como AMAA e VMAA, respectivamente. Além disso, AM e VM isolados de um coração que foi cânulado e ligado na raiz aórtica são representados como AMAR e VMAR, respectivamente. A Figura 2 mostra a visão geral das posições de aorta e transeção. Além disso, a Figura 3 mostra as profundidades e os locais de ligadura que correspondem às posições de transeção de aorta. A profundidade foi associada à perfusão dos assegos e atrial. Ambos os apêndices atrial são inflados quando a ponta da cânula está na aorta ascendente, indicando perfusão de atria suficiente. No entanto, quando na raiz aórtica, a perfusão de atria é insuficiente e ambos os apêndices atrial são enrugados (Figura 4). A morfologia e viabilidade cm que são isoladas dos corações cânulados em diferentes profundidades após a reintrodução do cálcio (Figura 5). As morfologias celulares de AMAA, AMAR, VMAA e VMAR estão sob o microscópio confocal antes e depois da reintrodução do cálcio. Os AMs são em forma de fuso, enquanto os VMs são em forma de haste com extremidades retangulares. Além disso, AMs e VMs têm membranas intactas, contornos claros, sarcomeres estriados claros e superfície lisa (Figura 6). A viabilidade celular foi avaliada através da coloração azul trypan. Células normais com membranas intactas podem excluir o azul trypan e não serão manchadas, enquanto a atividade de perda de células acumulará intracelularmente rapidamente azul trypan (Figura 7). AMs e VMs foram colocados em diferentes slides de objeto para realizar a contagem de células. Os rendimentos totais de AM e a porcentagem de CMs em forma de fuso viável (taxa de sobrevivência) foram determinados pela transferência de 10 μL da suspensão celular para um slide de objeto e contados sob um microscópio de contraste de fase invertido em 4 × 10 campos de visão. O mesmo método foi utilizado para determinar os rendimentos totais de VMs (em forma de haste) e a porcentagem de VMs viáveis. Este método é preferido em vez de usar um hemócito, pois os CMs não distribuíam facilmente para a área de contagem do hemócito devido ao seu tamanho e forma. Um gráfico de barras (Figura 8) mostra as taxas de sobrevivência de AMAA, AMAR, VMAA e VMAR antes e depois da reintrodução do cálcio. Cada valor representa a média ± SD de 10 ratos. Antes da reintrodução do cálcio, as taxas de sobrevivência da AMAA são significativamente maiores do que as da AMAR (70,9% ± 2,8% e 41,0% ± 5,2%, respectivamente; p < 0,01). Após a reintrodução do cálcio, as taxas de sobrevivência da AMAA são significativamente maiores do que as da AMAR (69,4% ± 3,0% e 37,7% ± 4,9%, respectivamente; p < 0,01). As taxas de sobrevivência do VMAA não diferem das do VMAR (89,5% ± 2,7% vs 88,1% ± 2,6%, respectivamente; p > 0,05) antes da reintrodução do cálcio. Da mesma forma, as taxas de sobrevivência do VMAA não diferem das do VMAR (82,2% ± 1,9% vs 82,9% ± 1,6%, respectivamente; p > 0,05) após a reintrodução do cálcio. Um coração cânulado em profundidade como este protocolo recomendava (na aorta ascendente), um rendimento viável de VMs e AMs de aproximadamente 4,1 milhões e aproximadamente 180.000, respectivamente, após a reintrodução do cálcio. O registro de grampo de remendo de células inteiras da corrente de sódio (Figura 9A, B) e as densidades atuais (Figura 9C) no AM e VM isolados confirmam que a qualidade da célula atendeu aos requisitos para experimentos eletrofisiológicos. A anatomia da aorta (Figura 10) mostra que o ostium do vaso atrial está próximo da raiz aórtica e é adjacente ao ostium da artéria coronária (AC). A Tabela 3 mostra a distância da ponta da cânula até o ostium CA de corações cânulados e ligados na aorta ascendente e na raiz aórtica, respectivamente. Figura 1. Diagrama esquemático de um sistema Langendorff modificado montado. Este sistema é econômico e portátil para os usuários. Possui duas partes de tubos plásticos um para a água (diâmetro interno, 8 mm) e uma para o perfusato (diâmetro interno, 1,5 mm)-do qual a extremidade distal é conectada a uma torneira médica de pe com uma trava Luer. Uma garrafa de vidro contendo água e com uma rolha de borracha forma como um trocador de calor. O perfusato é bombeado para dentro do tubo de plástico no trocador de calor pela bomba peristáltica e sai da torneira de três vias conectada à cânula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Aorta e tecidos ao redor. Uma estrutura de vasos sanguíneos em forma de “Y” é a aorta e seus ramos: a artéria braquiocefálica (seta 1) e a artéria carótida comum esquerda (seta 2). Transectar a aorta entre a artéria carótida comum esquerda (linha verde) e cortar simultaneamente a artéria braquiocefálica em alguns camundongos; transect na aorta ascendente (linha preta) em outros ratos (estereomicroscópio 10 × 2 ampliação). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. Vista frontal do coração cânulado. A linha curva preta representa a borda incisal da aorta que foi transectada entre a artéria carótida comum esquerda. A linha curva vermelha representa a borda incisal da aorta transectada na aorta ascendente. A linha reta representa onde a aorta foi ligatada: preta na aorta ascendente e vermelha na raiz aórtica (estereótipo 10 × 2 ampliação). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Estado de perfusão dos corações cânulados. Os atrias são suficientemente perfundidos, e ambos os apêndices atrial são inflados no coração (A) cânulados e ligados na aorta ascendente. No entanto, ambos os apêndices atrial são enrugados no coração (B) cânulados e ligados na raiz aórtica, indicando má perfusão de atria. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5. Morfologia celular e avaliação de viabilidade após a reintrodução do cálcio. As AMs (A) e VMs (B) isoladas do coração cânulado e ligadas na aorta ascendente são representados como AMAAs e VMAAs, respectivamente. As AMs (C) e VMs (D) isoladas do coração cânulado e ligadas na raiz aórtica são representadas como AMARs e VMARs, respectivamente. CMs de alta qualidade são quiescentes e têm membranas intactas, contornos claros, sarcomeres estriados claros e uma superfície celular lisa. Os AMs são em forma de fuso, enquanto os VMs são em forma de vara ou tijolo com extremidades retangulares. CMs que se contraem espontaneamente ou contêm blebs na membrana são de má qualidade, e aqueles que encolhem em uma forma esférica são células mortas. Um campo de visão aleatório (microscópio de fluorescência, 10 × 10 ampliação; barras de escala, 100 μm). AM = miócito atrial, VM = miócito ventricular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6. Morfologia celular sob um microscópio confocal antes e depois da reintrodução do cálcio. Antes da reintrodução do cálcio, AMAA (A) e AMAR (C) são em forma de fuso com contornos claros, sarcomeres estriados e superfícies de membrana lisa. Após a reintrodução do cálcio, AMAA (B) e AMAR (D) também são em forma de fuso com contornos claros, sarcomeres estriados e superfícies de membrana lisa. Antes da reintrodução do cálcio, vmaa (E) e VMAR (G) são em forma de vara ou tijolo com contornos claros, sarcomeres estrias e superfícies de membrana lisa com extremidades retangulares. Após a reintrodução do cálcio, vmaa (F) e VMAR (H) também são em forma de vara ou tijolo com contornos claros, sarcomeres estriados e superfícies de membrana lisa com extremidades retangulares (óleo de microscópio confocal, 63 × 10 ampliação; barras de escala, 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7. Avaliação de viabilidade celular. As células danificadas que perdem atividade são manchadas pelo azul trypan. Em contraste, as células viáveis não podem ser manchadas pelo azul trypan (microscópio de fluorescência, 4 × 10 ampliação; barras de escala, 100 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8. Gráfico de barras mostrando as taxas de sobrevivência de AMAA, AMAR, VMAA e VMAR antes e depois da reintrodução do cálcio. CR = reintrodução de cálcio. Cada valor representa a média ± SD de 10 ratos. p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Solução Conteúdo (concentração final em mmol/L, se não especificado de forma diferente) Observou Solução de perfusão (solução 1) 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurina, 5 Glicose, 10 2,3-butanedione monoxime (BDM) Que pode ser armazenado por 3 dias a 4 °C. Glicose, Taurina e BDM são adicionados no dia do experimento. Prepare 200 mL de solução de perfusão para cada coração. Solução de Tyrode (solução 2) 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 glicose Que pode ser armazenado por 3 dias a 4 °C. CaCl2 e Glicose são adicionados no dia do experimento, ajuste o pH para 7,3-7,4 com NaOH saturado à temperatura ambiente (28-30°C) com um medidor de PH. Mesa 1. Soluções para isolamento cm de rato adulto. Solução Conteúdo Observou Solução de digestão (solução 3) Solução 25 mL 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg de colagenase II, 50μL (2,5 % 10×) trypsin para cada coração Stop solução 1 (solução 4) Solução 9 mL 1, 1 mL FBS (Soro Bovino Fetal), 4μL 100 mM/L CaCl2 para cada coração Stop solução 2 (solução 5) Solução 9,5 mL 1, 0,5 mL FBS (Soro Bovino Fetal), 4μL 100 mM/L CaCl2 para cada coração Solução de resuspensão celular (solução 6) Solução de 13 mL 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) em uma dose que pode formar uma camada fina cobrindo a superfície do líquido para cada coração Mesa 2. Soluções para isolamento e armazenamento de CM de mouse adulto. Figura 9. Curvas de tensão corrente dos canais de sódio. Técnicas de grampo de remendo de células inteiras foram utilizadas para registrar correntes de sódio dos cardiomiócitos isolados no modo de fixação de tensão. O protocolo do grampo de tensão é mostrado no inset. As correntes de sódio registradas a partir dos AM (A) e VM (B) são mostradas. As densidades atuais em potenciais de −45mV, −40mV, e −35 mV são significativamente maiores em AM (−32,71 ± 1.597 pA/pF, −31,49 ± 1.820 pA/pF, e −29,34 ± 1.939 pA/pF, respectivamente; n = 10) do que em VM (−17,66 pA/pF ± 1.976 pA/pF, −21,09 ± 1.560 pA/pF, e −21,86 ± 1.381 pA/pF, respectivamente; n = 8; P < 0,05). (C) As curvas I-V mostram as densidades de corrente de sódio que foram normalizadas à capacitância celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 10. Origem e distribuição da nave atrial. O vaso atrial (seta 1) e o CA (seta 2) no painel A. O painel B é um olhar mais atento para a nave atrial (seta 3). (C) Existem dois ostia de tamanhos diferentes; uma (seta 4) corresponde ao vaso atrial que irrigava os apêndices atrial, e o outro (seta 5) corresponde ao CA (estereomicroscópio 10 × 5 ampliação). AC = artéria coronária. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. O número de série dos ratos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A profundidade da cannulação da aorta está na aorta ascendente 0.5 0.6 0.3 0.4 0.8 0.3 0.8 0.7 0.5 0.7 A profundidade da cannulação da aorta está na raiz aórtica 0.2 -0.1 0.1 0 -0.1 0.1 -0.2 0 -0.1 0 Mesa 3. Distância da ponta da cânula até o ostium da artéria coronária. Os corações de camundongos C57BL/6 (n = 20) foram usados para canonizar e ligante a aorta em profundidades da aorta ascendente e da raiz aórtica, respectivamente. A aorta é anatomizada, e a distância da ponta da cânula até o ostium ca foi medida. A distância é medida em milímetros, e sinais positivos ou negativos representam a ponta da cânula acima e abaixo do ostium CA, respectivamente.

Discussion

O Único CM é uma ferramenta valiosa e indispensável em estudos de nível celular de função cardíaca e ^doenças20. Assim, o isolamento de CMs viáveis dos corações é o passo inicial e mais crucial. A qualidade celular é um dos determinantes significativos da realização de experimentos bem-sucedidos, especialmente em experimentos ópticos e eletrofisiológicos. Em comparação com os CMs de outros animais, os CMs de roedores são mais vulneráveis à isquemia e hipoxia devido a uma maior concentração de íons de sódio intracelulares, o que favorece o fluxo de cálcio através do trocador Na⁺/^Ca2+. Além disso, o número de AMs é muito menor do que o dos VMs; assim, o isolamento bem sucedido é extremamente difícil de alcançar. O método Langendorff é excelente para isolar os ^VMs22 de camundongos, mas a taxa de sucesso em isolar AMs é baixa, e poucos relatórios estão disponíveis. A profundidade adequada da cannulação da aorta também é um fator essencial para produzir VMs ideais além da temperatura, atividade enzimápica, PH e qualidade da água utilizada para a preparação do tampão. O princípio do método Langendorff baseia-se na perfusão retrógrada do coração. Após a perfusão, a válvula aórtica é fechada; assim, o perfusato é forçado para as artérias coronárias, fornecendo solução enzimápica através dos ramos do vaso, e o tecido miocárdio é uniformemente digerido. Para alcançar esse tipo de padrão de circulação, a aorta deve reservar comprimento suficiente para a canulação e a ligadura, também a ponta da cânula não deve penetrar nas válvulas aórticas ou bloquear o ostium CA. Assim, é razoável especular que a profundidade da cannulação da aorta também está associada à perfusão atria, que afeta a eficácia da digestão da atria e os rendimentos do AM de forma semelhante. O protocolo aqui apresentado confirmou a hipótese, e são observados passos cruciais para a otimização do rendimento celular, juntamente com as sugestões.

Na etapa 1.9, para melhor fixar a aorta, recomenda-se uma cânula de 20 G com um entalhe (ou uma ranhura circunferencial) de onde a distância é de 1 mm até a ponta. Com base em nossas experiências, o tamanho da cânula um pouco maior que o diâmetro da aorta foi encontrado para evitar que a ponta da cânula perfurasse as válvulas aórticas durante a cannulação porque a aorta, contando com sua elasticidade intrínseca, pode se encaixar na cânula e produzir atrito, que age como um fator protetor ao se mover para frente ou para trás ajustando a profundidade da cânula. Em termos de posição do entalhe, o coração facilmente escorregará durante a canulação por causa da gravidade se estiver muito perto da ponta da cânula. Por outro lado, o espaço para ajustar a profundidade de cannulação e a posição de ligadura serão muito confinados se for longe demais. Dadas essas circunstâncias, a transecção da aorta entre a artéria carótida comum esquerda (como a linha verde na Figura 2) para garantir que a aorta seja longa o suficiente e possa ser cânulada e ligada na aorta ascendente é melhor no passo 3.3. Considerando que a transecção na aorta ascendente, o comprimento reservado para a cannulação pelo menos poderia fixar a ponta da cânula perto da raiz aórtica e não penetrará nas válvulas aórticas após a ligadura. A anatomia da aorta e a medição da distância da ponta da cânula até o ostium ca indicam que a transecção da aorta entre a artéria carótida comum esquerda é uma posição ideal para alcançar uma profundidade adequada de cannulação de aorta.

A profundidade de cannulação foi encontrada associada à perfusão da átrida, que por sua vez atua como um indicador de profundidade. A Figura 4 mostra que a perfusão de atria é boa quando a profundidade está na aorta ascendente, e ambos os apêndices atrial são inflados. No entanto, a perfusão de atria é insuficiente quando a profundidade está (ou se aproximando) da raiz aórtica e ambos os apêndices atrial são enrugados. A contagem total e viável de AM rendendo dos apêndices atrial inflados foi maior (Figura 8). Esses achados indicam que a profundidade da cannulação da aorta pode afetar a perfusão e digestão dos apendices atria e atrial de uma certa forma e finalmente afetar o rendimento e a qualidade do AM. O rendimento e a qualidade do AM foram inferidos para estarem associados à distribuição dos navios que fornecem o atria. O estudo de Fernández et ^al.23 demonstrou várias anomalias na origem e curso do CA do rato. Eles descobriram que as ostia dos CAs eram altamente variáveis e não estavam todas localizadas no seio aórtico. Alguns CAs podem se originar anômalamente de cima dos seios aórticos, chamados de ostium de decolagem alta. Alguns CAs podem se originar do mesmo seio aórtico, e o ostium do vaso átrio está próximo. A anatomia da aorta no presente estudo (Figura 10) também é consistente com a descoberta de Fernández. Esta pode ser a causa pela qual as tentativas de isolar a AM pelo método Langendorff não tiveram sucesso se a profundidade da cannulação não for apropriada. Assim, a ponta da cânula terá maior chance de bloquear o ostium do vaso átrio que é adjacente ao ostium CA se não houver espaço suficiente entre a ponta da cânula e o ostium CA. Em contraste, a perfusão e o rendimento celular do ventrículo dificilmente foram afetados, desde que as válvulas aórticas não fossem penetradas pela ponta da cânula. Isso provavelmente é porque os CAs que fornecem sangue para o ventrículo têm ostia maior e mais origens. Se um ostium foi ocluído pela cânula, a perfusão ventrículo pode ser compensada por outro CA ou pela circulação colateral, enquanto o vaso sanguíneo que abastece o átrio é bastante pequeno e não tem substituto. Assim, a influência da profundidade na cannulação da aorta é importante.

Outros fatores notáveis e problemas de solucionação no processo de digestão e armazenamento de células estão listados da seguinte forma. Primeiro, considere perfusar a solução oxigenada de Tyrode na etapa 4.1 para fazer o músculo contraír e bombear sangue residual se o sangue na ária não tiver sido retirado após a ligadura da aorta. Isso pode ajudar a evitar o efeito adverso de ^ca2+ e outros materiais liberados dos eritrócitos danificados. Em segundo lugar, perfusar a solução ^ca2+-free com antecedência para dissociar a conexão e expandir o espaço entre as células pode melhorar a eficácia da digestão enzimática porque discos intercalados entre CMs são junções intercelulares dependentes de cálcio. No entanto, o tempo deve ser limitado a 3-5 min para evitar o fenômeno paradoxo do ^cálcio24. Recomenda-se uma solução enzimápica mista. A colagenase tipo II interrompe a rede de matriz extracelular, e a trippsina ajuda a limpar o material granular que permanece na superfície da célula se a digestão da colagemnase II estiver incompleta. Isso garante uma superfície celular lisa, que é fundamental para formar uma vedação GΩ na gravação do grampo de remendo. No entanto, a concentração de trippsina deve ser controlada na faixa adequada para evitar sobre digestão e lesões celulares, pois pode degradar a proteína da membrana. O uso do tipo 2 de colagenase sozinho para melhorar o rendimento celular pode muitas vezes levar à digestão do tecido, e os CMs isolados serão intolerantes ao cálcio após exposição prolongada à ^{colagemnase25}. O uso de monoxime de 2,3 butanedione (BDM), substância que previne a contração espontânea inibindo a mosina ATPase e prevenindo a formação de pontes cruzadas, ainda é controverso26,27,28,29. De acordo com a experiência anterior, a adição de BDM é necessária para este protocolo. A solução enzimápica é preparada com a solução 1, embora a solução 1 não contenha cálcio, e o cálcio é adicionado para ativar a enzima. O benefício da adição de BDM na solução de perfusão inclui (1) inibir a contração dos miócitos e reduzir o consumo de oxigênio durante a perfusão da solução enzimante e (2) prevenir miócitos de hipóxia e melhorar a qualidade dos miócitos isolados. Alguns estudos relataram que o BDM pode ter uma influência adversa potencial nas propriedades elétricas celulares. No entanto, os resultados do registro do grampo de remendo de células inteiras da corrente de sódio não indicaram um efeito indesejável. Na etapa de armazenamento celular (etapa 6), inúmeros estudos escolheram o tampão KB, uma solução de concentração de potássio livre de cálcio, mas alta, na qual as células podem manter um estado melhor porque estão em condições metabólicas polarizadas e baixas. No entanto, o gllicocalyx da membrana celular se separará da bicamada lipídica na ausência de cálcio exógeno por um determinado período de tempo e a permeabilidade da membrana aumentará, afetando a análise funcional subsequente30,31,32.

Todas as técnicas de isolamento de miócitos podem ser essencialmente categorizadas atualmente em uma digestão de um pedaço (um pequeno pedaço de tecido) em uma solução enzimática ou perfusão de CA com solução enzimática (a perfusão langendorff)²². Comparado com o método Langendorff, o método de digestão de pedaços é mais fácil de executar e também é usado rotineiramente para isolar CMs em muitos laboratórios. No entanto, este método normalmente produz um baixo rendimento de CMs de má qualidade a partir de tecidos ^adultos22. Além disso, as células isoladas por este método podem não ser adequadas para a realização de experimentos comparativos. Por exemplo, ao testar os efeitos de drogas específicas do tipo celular entre AM e VM, o impacto de diferentes condições de isolamento não pode ser negligenciado ou excluído. Isso porque o miocárdio e a densidade tecidual do ventrículo são muito mais espessos e mais densos que os do átrio, resultando em diferentes tempos de digestão e concentrações enzimáticas. Além disso, a agitação excessiva e a tubulação do tecido durante a digestão danificarão as células e impactarão significativamente os estudos funcionais. Além disso, muitos estudos anteriores mostraram que as AMs são mais vulneráveis ao cálcio. No entanto, as AMs isoladas pelo protocolo atual podem ser tolerantes à reintrodução gradiente de cálcio provavelmente porque o tecido é fácil de romper no final do processo de digestão. Assim, o dano mecânico é menor, enquanto as células sofreriam mais danos mecânicos, pois as etapas do método do pedaço precisam de ruptura repetida e centrífuga. Mais recentemente, Ackers et ^al.33 relataram um método simplificado, livre de Langendorff para o isolamento de miócitos cardíacos viáveis e não-miócitos. Os VMs e os fibroblastos podem ser efetivamente isolados, mas a quantidade de AMs não foi mencionada. No entanto, este protocolo tem várias limitações. Em primeiro lugar, a distribuição dos vasos sanguíneos cardíacos pode ter variações para diferenças individuais e cepa de camundongos, e a profundidade de cannulação recomendada não pode garantir um isolamento bem sucedido de AMs para cada vez. Em segundo lugar, para aqueles que são novos nesse procedimento pode levar um certo tempo para praticar a transção aorta e a canulação de aorta retrógrada. Finalmente, este método não foi testado em outros modelos de doenças cardíacas, exceto em camundongos saudáveis e idosos. Assim, exigirá ajustes nas concentrações enzimáticas e tempo de digestão devido à extensão da fibrose do coração. A desvantagem das diferentes condições de digestão encontradas no método do pedaço não será um problema no método Langendorff no qual a solução enzimácida é distribuída uniformemente ao tecido pelos leitos dos vasos.

Em resumo, os protocolos para o isolamento simultâneo de am único e VM descrito aqui demonstraram que a profundidade adequada da aorta cannulation pode efetivamente melhorar a perfusão do átrio e o rendimento am. Os CMs isolados por este método são de alta qualidade, possuem boa tolerância ao cálcio, e têm sido aplicados com sucesso no registro de grampos de remendo e manuseio de cálcio (liberação ^Ca2+ e medição de ondas ^Ca2+ pelo sistema IonOptix) na ^equipe34. Prevê-se que o protocolo de isolamento possa ser utilizado para preparação celular em uma série de investigações celulares e subcelulares, o que ajudará a aprofundar a compreensão da fisiologia cardíaca e da patologia. É importante ressaltar que permitirá a descoberta de mecanismos de doenças cardíacas mais clinicamente relevantes e métodos de intervenção.

Materials

2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	31550
Bull Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Collagenase type II	Worthington	43D14160
Excel			data acquisition and analysis
Fetal Bovine Serum (FBS)	Zhejiang Tianhang Biotechnology	150207
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
KHCO3	Sigma-Aldrich	237205
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA,US		data acquisition and analysis
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-2J
Sodium pentobarbital	Shanghai Reagent Factory	810923
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trypan blue	Solarbio	C0040
Trypsin	Invitrogen	15090046
Water bath	JULABO	ED (v.2)