Användningen av artificiell intelligens (Ai) för att analysera bilder framträder som ett kraftfullt, mindre partiskt och snabbt tillvägagångssätt jämfört med vanliga metoder. Här tränade vi Ai att känna igen en cellulär organell, primär cilia, och analysera egenskaper som längd och färgningsintensitet på ett rigoröst och reproducerbart sätt.
Cilia är mikrotubulebaserade cellulära bilagor som fungerar som signalcentra för en mångfald av signalvägar i många däggdjurscelltyper. Cilialängden är mycket bevarad, hårt reglerad och varierar mellan olika celltyper och vävnader och har varit inblandad i att direkt påverka deras signalkapacitet. Till exempel har cilia visat sig ändra sina längder som svar på aktivering av ciliary G protein-kopplade receptorer. Men att noggrant och reproducerbart mäta längden på många cilier är ett tidskrävande och arbetsintensivt förfarande. Nuvarande tillvägagångssätt är också fel- och partiska. Ai-program (Artificial Intelligence) kan användas för att övervinna många av dessa utmaningar på grund av funktioner som tillåter assimilering, manipulering och optimering av omfattande datauppsättningar. Här visar vi att en Ai-modul kan tränas att känna igen cilia i bilder från både in vivo- och in vitro-prover. Efter att ha använt den utbildade Ai för att identifiera cilia kan vi designa och snabbt använda applikationer som analyserar hundratals cilier i ett enda prov för längd, fluorescensintensitet och samlokalisering. Detta opartiska tillvägagångssätt ökade vårt självförtroende och stringens när vi jämförde prover från olika primära neuronala preps in vitro samt över olika hjärnregioner inom ett djur och mellan djur. Dessutom kan denna teknik användas för att tillförlitligt analysera cilia dynamik från alla celltyper och vävnad på ett sätt med hög genomströmning över flera prover och behandlingsgrupper. I slutändan kommer Ai-baserade metoder sannolikt att bli standard eftersom de flesta fält rör sig mot mindre partiska och mer reproducerbara metoder för bildförvärv och analys.
Primära cilier är sensoriska organeller som sticker ut från de flesta däggdjurscelltyper1,2,3,4. De är i allmänhet ensamma bilagor som är kritiska för att samordna olika cellsignaleringsvägar genom att integrera extracellulära signaler5,6,7. Primära cilia spelar viktiga roller under embryonal utveckling och vuxna vävnad homeostas, och störningar av deras funktion eller morfologi är associerad med flera genetiska störningar, som kollektivt kallas ciliopathies. På grund av cilias nästan allestädes närvarande natur är ciliopatier förknippade med ett brett spektrum av kliniska funktioner som kan påverka alla organsystem8,9,10,11,12. I djurmodeller av ciliopatier manifesteras förlust av ciliär struktur eller signalkapacitet i flera kliniskt relevanta fenotyper inklusive hyperfagiassocierad fetma3,13,14,15. I många modellsystem har cilialängdsändringar visat sig påverka deras signalkapacitet och funktioner16,17,18,19. Det finns dock flera tidskrävande och tekniska utmaningar förknippade med att noggrant och reproducerbart bedöma cilia längd och sammansättning.
Det vuxna däggdjurets centrala nervsystem (CNS) är ett biologiskt sammanhang som har inneburit en utmaning för att förstå cilia morfologi och funktion. Medan det verkar som om nervceller och celler i hela CNS har cilier, på grund av de begränsade verktygen och förmågorna att observera och analysera dessa cilier förblir en förståelse av deras funktioner svårfångad20. Till exempel märker den prototypiska ciliamarkören, acetylerad α-tubulin, inte neuronala cilia20. Svårigheten att studera dessa cilier löstes delvis med upptäckten av flera G-proteinkopplade receptorer (GPCR), signalmaskiner och membranassocierade proteiner som berikas på membranet av neuronal cilia21,22. Alla dessa enkla grundläggande observationer antyder vikten och mångfalden av CNS cilia, som hittills verkar oöverträffad av andra vävnader. Till exempel kan variation i cilialängd och GPCR-lokalisering observeras i hela hjärnan, med längder i vissa neuronala kärnor som är olika jämfört med andra kärnor19,23. På samma sätt visar deras GPCR-innehåll och signalmaskiner komplimanger mångfald baserat på neuroanatomisk plats och neuronal typ2,24,25,26,27,28,29. Dessa enkla observationer visar att däggdjur CNS cilia längd och sammansättning är tätt reglerade, precis som i modellorganismer, som Chlamydomonas reinhardtii, men effekten av dessa längdskillnader på cilifunktion, signalering och i slutändan beteende förblir oklart16,30,31,32.
Att noggrant mäta cililängd och sammansättning visar sig vara en teknisk utmaning som är benägen för användarfel och irreproduktivitet. För närvarande identifieras cilia in vivo och in vitro oftast med hjälp av immunofluorescent metoder som märker ciliary proteiner eller cilia-berikade fluorescerande reporter alleler33,34,35. Längden på dessa fluorescerande taggade cilia mäts sedan från en 2-dimensionell (2D) bild med hjälp av linjemätningsverktyg i bildanalysprogram som ImageJ36. Denna process är inte bara tråkig och arbetsintensiv utan också benägen för partiskhet och fel. Samma hinder uppstår vid mätning av cilia-intensiteter, vilket hjälper till att indikera förändringar i cilia struktur37. För att minimera inkonsekvenserna i dessa typer av bildanalyser blir ai-program (artificiell intelligens) allt vanligare och billigare alternativ38.
Ai är utvecklingen av datorsystem som använder fördelen med datoralgoritmer och programmering för att utföra uppgifter som vanligtvis skulle kräva mänsklig intelligens39. Ai-enheter lär sig att uppfatta återkommande mönster, parametrar och egenskaper och vidta åtgärder för att maximera oddsen för att skapa framgångsrika resultat. Ai är mångsidigt och kan tränas för att känna igen specifika objekt eller strukturer av intresse, till exempel cilia, och sedan programmeras för att köra en mängd olika analyser på de identifierade objekten. Därför kan komplexa bilddata genereras snabbt och reproducerbart av Ai38. Automatisering och Ai-analys av tagna bilder kommer att öka effektiviteten och effektiviteten samtidigt som eventuella mänskliga fel och partiskhetbegränsas 39. Att etablera en Ai-baserad metodik för ciliaidentifiering skapar ett konsekvent sätt för alla forskargrupper att analysera och tolka ciliadata.
Här använder vi en Ai-modul för att identifiera cilia både in vivo och in vitro på 2D-bilder. Med hjälp av en uppsättning exempelbilder tränas Ai:n för att identifiera cilia. När träningen är klar används den angivna Ai för att tillämpa en binär mask över Ai-identifierade cilia i en bild. De binärfiler som tillämpas av Ai är modifierbara, om det behövs, för att säkerställa att alla cilia i bilderna identifieras korrekt och att icke-specifik identifiering elimineras. Efter att ha använt Ai för att identifiera cilia används specialbyggda allmänna analysprogram (GA) för att utföra olika analyser som att mäta cililängd och fluorescensintensitet. De insamlade uppgifterna exporteras till en tabell som lätt kan läsas, tolkas och användas för statistiska analyser (figur 1). Användningen av automatiserad teknik och Ai för att identifiera cilia och få specifika mätningar mellan experimentella grupper kommer att hjälpa till i framtida studier som syftar till att förstå effekten av CNS cilia-funktion och morfologi på cellcellskommunikation och beteende.
Längd- och intensitetsmätningar är vanliga sätt som primära cilia analyseras, men det finns ingen standardiserad konventionell metod som används i fältet. Identifiering och kvantifiering av primära cilier med hjälp av programvara som ImageJ är tidskrävande och benägen för användarens partiskhet och fel. Detta gör det svårt att noggrant analysera stora datamängder. Här visar vi att användning av ett Ai-program kan övervinna många av dessa utmaningar vilket gör hög genomströmningsanalys av primära cilia uppnåeliga. Här beskriver vi proceduren för att träna en Ai-baserad applikation för att känna igen primära cilier och beskriva de steg som krävs för att analysera längd och intensitet.
Medan den inledande utbildningen av Ai för att känna igen cilia kräver betydande tid från användaren, kan den användas på alla datauppsättningar som förvärvats med samma parametrar när den är klar. Den binära masken som genereras av Ai:n kan ändras så att eventuella fel kan korrigeras. Fel i cilia-identifieringen bör dock signalera användaren att Ai behöver ytterligare tränas med ytterligare bilder. En stor fördel med denna metod är att Ai kan tränas att känna igen cilia i olika provtyper i både 2D och 3D. Tidigare analysmetoder som genereras inom laboratorier har olika begränsningar, inklusive att kräva manuell tröskel för identifiering och problem med att identifiera cilia avbildade från vävnadssektioner där celltätheten är hög36,46,47. Dessa metoder är också specialiserade för cilia-analys medan analys med NIS Elements programvara kan utvärdera flera aspekter av bilderna samtidigt. Eftersom Ai som beskrivs här är en del av NIS Elements mjukvarupaket kan bilder som förvärvats med hjälp av ett Nikon-mikroskop enkelt fortsättas till analys. Avbildning med Nikon krävs dock inte för användning av denna metod. Oavsett det infångade rådatafilformatet kan “.tif” filer öppnas av NIS Elements att använda i Ai.
Denna Ai-applikation inom NIS Elements är allmänt tillgänglig och möjligen redan en del av bildanalysprogramvara som används av laboratorier som studerar primära cilier. När förekomsten av Ai-teknik expanderar kan annan bildbehandlingsprogramvara utöka sina analysalternativ till att omfatta en liknande Ai-modul. Att tillämpa Ai-analys på ciliaidentifiering kan användas för flera olika aspekter av ciliaanalys. Medan vi skisserade metoder för några enkla analyser som längd (figur 2 och 3), intensitet (figur 4) och colocalization (figur 5) kan mer sofistikerad analys läggas till GA3-analysarbetsflödet som i figur 6. I stället för att mäta intensiteten hos ett komplett cilium kan till exempel skillnader i intensitet inom en delregion av ett cilium vara av intresse för att bedöma sub-ciliary lokalisering. Skillnader i intensitet inom en underregion av ett cilium kan tyda på att proteinet ackumuleras vid spetsen eller basen av ciliumet, till exempel hur Gli-proteiner berikas vid spetsen av cilia48. Dessutom kan denna Ai-applikation användas för att enkelt identifiera skillnader mellan genotyper eller behandlingsgrupper. Medan vårt labb främst använder denna metod för att analysera cilia avbildade från hjärnsektioner eller neuronala kulturer, kan det tillämpas på bilder som förvärvats från olika cellinjer eller andra vävnadstyper. Flexibiliteten hos provtyp som denna applikation kan användas på gör denna analysmetod värdefull för många olika grupper som studerar primära cilier eller någon diskret organell som bedöms såsom mitokondrier, kärna eller ER.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 till NFB och American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 till RB. Vi tackar Rich Gruskin General Manager för Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft och Teresa Mastracci för insiktsfulla kommentarer om manuskriptet.
Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM | Intel Corporation | W-2123 | Processor used for running NIS Elements. |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments Inc. | – | Ai and GA3 software |
Quadro RTX 4000 Graphics card | NVIDIA Corporation | Quadro RTX 4000 | |
Windows 10 Professional 64-bit | Microsoft Inc. | – | Operating system used for running NIS Elements |
Workstation | HP Development Company, L.P. | HP Z4G4 | Workstation used for running NIS Elements |