Her presenterer vi en protokoll for den optimaliserte FlashPack kapillære kolonnepakkingsprosedyren. Bruk av en optimalisert protokoll til et vanlig 100-bar trykkbombeoppsett gir 10 ganger raskere pakking og produksjon av lange kapillære kolonner med ultrahøy ytelse.
Kapillær ultrahøy væskekromatografi (UHPLC) er for tiden en metode for valg for prøveseparasjonstrinnet i LC-MS-basert proteomikk. Kapillære kolonner er imidlertid mye mindre robuste sammenlignet med deres høyere strømningstellertyper. På grunn av enkel forurensning og blokkering trenger de ofte utskifting. Det gjør dem til en markant dyr del av den totale LC-MS-analysekostnaden. Intern pakking av UHPLC kapillære kolonner sparer mye penger og tillater tilpasning. Standard pakkeprosedyre i 100-bar trykkbombe fungerer imidlertid bra bare for HPLC-kolonner, men er for treg for UHPLC-sorbenter. Her gir vi en beskrivelse av en optimalisert FlashPack-protokoll som brukes på det samme 100-bar trykkbombeoppsettet. Metoden er basert på pakking fra ultrahøy sorbent konsentrasjonsslam og er utviklet for intern produksjon av UHPLC kapillære kolonner med ubegrenset lengde i rimelig tid.
Moderne proteomikk er basert på flytende kromatografi-koblet massespektrometri med ultra-høy ytelse nano-flow kromatografi (50-150 μm kolonne intern diameter (ID)) separasjon som gir den beste analysehastigheten ogfølsomheten 1. Mens mange kommersielle UHPLC kapillærkolonner er tilgjengelige, utgjør prisen en stor del av forbrukskostnadene, spesielt når flere forskjellige prosjekter kjøres i laboratoriet og prosjektspesifikk kolonneforurensning er et hyppig problem. Dessuten tillater pakking av kolonner internt bruk av tilpassede eksperimentspesifikke sorbenter (for eksempel polyCAT-A sorbent2) og kolonnekarakteristikker som ikke er tilgjengelige for kjøp som en ferdig kolonne.
For å takle det, pakker mange laboratorier kapillære kolonner internt. Imidlertid er den vanlige pakkeprosedyren med en 100 bar trykkbombe (trykkinjeksjonscelle)3 dårlig egnet til UHPLC-kolonnepakken på grunn av høyt ryggtrykk av sub-2 μm UHPLC-sorbenter, noe som resulterer i en dramatisk pakkehastighetsreduksjon i forhold til større HPLC-sorbenter. Selv om korte UHPLC-kolonner fremdeles kan pakkes veldig sakte, er produksjon av lange UHPLC-kolonner fysisk umulig4.
Standard kapillær kolonne pakking gjøres ved relativt lavt trykk opp til 100 barer, og med en svært lav sorbent slurry konsentrasjon. Derfor er to mulige retninger for å øke hastigheten på prosessen tilgjengelig. Det er mulig å øke pakketrykket5. Dette krever imidlertid spesialutstyr og praktisk talt installasjon av en ny metode i laboratoriet. En annen måte er å øke den sorbente slurrykonsentrasjonen6. Høy sorbent slamkonsentrasjonspakking er beskrevet i kombinasjon med ultrahøyt pakketrykk i en tidligere publikasjon7. Men ved 100 bar trykk, som brukes i de fleste av de eksisterende pakkebomber, høyere sorbent konsentrasjon resulterer i enten pakking rate slow-down eller direkte pakking opphør. Effekten ble nylig vist å skyldes sorbent klynger ved kolonneinngangen, og et enkelt triks av sorbent cupola destabilisering ved å hamre kolonneinngangen med en magnetstang inne i et sorbent hetteglass ble foreslått4. Den resulterende metoden, kalt FlashPack, bruker det samme 100-bar trykkbombepakkeoppsettet. Samtidig tillater mindre, men kritiske endringer i pakkeprosedyren pakking fra svært høy sorbent slurrykonsentrasjon og produksjon av svært lange UHPLC-kolonner (50 til 70 cm og lengre) på mindre enn en time, mens en kort kolonne kan produseres på få minutter med separasjonskvaliteten lik kommersielle kolonner med de samme parametrene4. FlashPack-tilnærmingen ble allerede brukt i flere proteomikkprosjekter for fremstilling av både omvendt fase (RP)8,9,10,11,12,13,14 og hydrofil interaksjon (HILIC)2 kapillære kolonner.
Her beskriver vi i detalj modifikasjonene som trengs for tilpasning av FlashPack-tilnærmingen til standard 100-bar trykkbombepakkeprosedyre.
Innebygd kapillær kolonne pakking er svært populært i store laboratorier som jobber med flere uavhengige prosjekter. En vanlig pakkemetode fra en sorbent suspensjon med lav konsentrasjon har imidlertid store begrensninger i hastigheten og kan ikke produsere lange UHPLC-kolonner.
FlashPack er en modifikasjon av standard pakkeprosedyre som gjør pakking fra en svært høy sorbent konsentrasjon mulig. Det teoretiske grunnlaget for metoden ligger i den kontinuerlige sorbente cupola destabiliseringen ved kolonneinngangen for hele pakkevarigheten. Sistnevnte oppnås teknisk ved at kolonneinngangen kontinuerlig blir truffet med en magnetstang. Metoden for cupola destabilisering er med vilje utviklet for å få pakkeoppsettet helt lik den vanlige pakkeprosessen, men trikset med FlashPack ligger i detaljene i den sorbente slurrypreparatet, kapillær posisjonering og magnetstangbruk under pakkeprosessen.
Den sorbente slurry fremstilles som et sediment sorbent lag i et stort løsningsmiddelvolum. Det er interessant at trykkbombebasert pakking ikke krever de samme pakkebetingelsene for kolonne til kolonne. I FlashPack kjenner vi aldri den eksakte sorbente slurrykonsentrasjonen rundt kolonneinngangen. Det er umulig å måle og kontrollere nøyaktig, da det også endres under pakkeprosessen. Imidlertid er de endelige kolonnene fortsatt svært reproduserbare4 uavhengig av hvordan pakkingen ble oppnådd.
Grunnlaget for rask pakking ligger i effektiv sorbent cupola destabilisering. Av denne grunn er det viktig å kontrollere sorbent inn i kapillæren og opprettholde de optimale cupola destabiliseringsforholdene gjennom hele emballasjevarigheten. Det er flere mulige problemer som kan forhindre effektiv sorbent levering. Noen eksempler på disse er sorbent lag resuspension ved rask magnetisk bar rotasjon, ineffektiv cupola destabilisering på grunn av enten feil relativ kapillær til magnet bar posisjonering eller for langsom magnet bar rotasjon. Problemstillingene selv og hvordan de skal løses diskuteres i detalj i protokolldelen.
Når kolonnen er pakket, er den viktigste kolonneparameteren som skal kontrolleres, tilbaketrykket for kolonnen. Trykkverdiene som er oppført i tabell 5 gir et referansepunkt til hva som forventes for en av de populære sub 2 μm perlestørrelse sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Samtidig kan ytterligere tilbaketrykk legges til av friten eller en for smalt trukket emitter, og man bør hele tiden overvåke for det. Hvis pakking gjøres i en trukket emitter, foreslår vi fortsatt å måle forventet kolonne backpressure for den spesielle sorbent i bruk ved å pakke fritted kapillærer først, og deretter for å se om den selvmontering frit legger til for mye. For eventuelle høytrykksproblemer, bruk retningslinjene i tabell 1 for å finne problemet.
Vår erfaring er at en pakket kolonne uten misfarginger, hull og med riktig backpressure fungerer i 100% av tilfellene og gir separasjonskvaliteten nær det som kan forventes fra kolonnelengden og sorbente egenskaper. En kolonne med misfarginger er ikke garantert å fungere ordentlig, men kan fortsatt gi tilfredsstillende resultater.
Mesteparten av tiden, hvis det er noen problemer med separasjonskvaliteten, kommer de ikke fra selve kolonnen, men heller fra andre deler av separasjonssystemet, nemlig pumper, løsningsmidler eller tilkoblinger. Spesielt potensielt skadelig er eventuelle tilkoblinger etter kolonnen. Dårlig forbindelse med et dødt volum mellom emitteren og den frittede kolonnen fører til stor topp utvidelse og tailing på grunn av svært lave strømningshastigheter i kapillær kromatografi.
Et annet viktig problem som er spesifikt for FlashPack-tilnærmingen, er at den bruker mange dyre sorbenter i et fungerende sorbent slurry hetteglass. Husk at den sorbente slurryen i FlashPack er beregnet for flerbruk. Ta vare på sorbenten. Unngå unødvendig magnetstangrøring for å redusere sorbent sliping-husk å stoppe rotasjonen så snart emballasjen er ferdig. Og ikke la det åpne sorbente hetteglasset ligge i trykkbomben for å unngå sorbent tørking. Selv om sorbenten fortsatt kan brukes etter det, tar det tid å gjenskape den sorbente slurryen.
Metoden fungerer like bra for både fritted kapillærer og pulled-emitter kapillærer. FlashPack-prinsippet øker emballasjehastigheten for kapillære IDer fra 20 til 250 μm (mindre og større ble ikke testet). Det gjelder også alle sorbentene, både fullt og overfladisk porøse, vi kunne teste (reflekterer at den sorbente cupolaformasjonen i høy sorbent slurry konsentrasjon ikke er begrenset spesielt til RP-sorbenter). Dessuten påvirker løsningsmiddelparametere tydelig pakkingen i henhold til deres fysiske og kjemiske egenskaper. For eksempel gir mindre viskøs aceton enda høyere emballasjehastighet enn metanol ved samme pakketrykk. Imidlertid er det også mindre polart enn metanol og reduserer sorbente partikler som holder seg til hverandre. Effekten i seg selv forhindrer sorbent cupoladannelse i begynnelsen av pakningen når strømningshastigheten fortsatt er høy. Reduksjon i sorbent partikkelinteraksjon fører imidlertid også til mindre pålitelig selvmontering av fritformasjon og hyppigere trukket-end blokkering under pakkingen. Så, mens aceton er bedre for pakking av fritted kapillærer, er den mindre egnet for pulled-emitter kapillærer, med metanol som et slurry løsningsmiddel som er langsommere, men egnet for begge typer slutt. Pakking fra heksan eller dichloromethane (DCM) er ekstreme tilfeller av å bytte til aceton fra metanol: de er enda mindre polare, så de forhindrer sorbent cupoladannelse helt, men de er ikke egnet for trukket emitterpakking i det hele tatt. Dessuten ble det bemerket at ekstremt lav DCM-polaritet fører til at sorbente partikler stikker til den indre kapillærveggen og lager et tykt lag på den. Lagtykkelsen vokser gradvis og tilfeldige lokale blokker dannes, noe som resulterer i kolonnen pakket i flere deler atskilt av regioner uten sorbent. Slik effekt ble observert for C18 PeptidE Aeris sorbent.
Et annet observert problem var YMC Triart C18 sorbent ikke blir suspendert i metanol riktig, men å danne en slags flak. Det forhindrer imidlertid ikke at den blir fullpakket med FlashPack og gir veldig anstendig separasjonseffektivitet (upubliserte data). Således, selv om det ikke var optimalt for noen tilfeller, var metanol det mest universelle løsningsmidlet som fungerte for alle testede sorbenter og kolonner. Det er nødvendig å nevne at vi ennå ikke analyserte hvordan forskjellige slurry løsemidler påvirker kolonneseparasjonseffektiviteten. Samtidig er effektiviteten til kolonner pakket fra metanol allerede helt lik kommersielle kolonner for samme sorbents4.
FlashPack er ikke den eneste eksisterende tilnærmingen for å forbedre emballasjehastigheten til UHPLC-kolonner. Rask pakking fra høy sorbent slurry konsentrasjon er også mulig ved bruk av ultra-høytrykk pakking7. Fordelen med FlashPack er at den er mye enklere, da den ikke krever spesielle ultrahøytrykkspumper og trykkbomber for sorbent levering og kapillære tilkoblinger. Samtidig ble det demonstrert at kolonnene pakket ved ekstreme trykk kan ha separasjonseffektivitet høyere enn lavere trykkpakkede kolonner17. Og mens FlashPack produserer kolonner som er identiske med kommersielle som brukes i sammenligningen4, som vi ikke kjenner pakkemetoden for, ble den ennå ikke testet hvordan FlashPack-kolonner står mot ultrahøytrykkspakkede kolonner.
Oppsummert kan den beskrevne FlashPack-metoden enkelt tilpasses den eksisterende pakkeprotokollen i laboratoriet med noen justeringer i protokollen, mens oppsettet forblir helt det samme. Den fremskynder HPLC kapillærkolonnepakking til minutter og tillater produksjon av lange UHP kapillærkolonner, noe som er helt klart umulig med standard pakkeprosedyre. Den samlede økonomien i tid og penger for laboratoriet ved bruk av FlashPack-tilnærmingen kan telles i titusenvis av euro per år. I tillegg åpner muligheten til å produsere UHP kapillære kolonner lokalt mulighetene for eksperimenttilpasning umulig med de tilgjengelige kommersielle produktene.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av RSF grant 20-14-00121. Forfatterne takker P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) for fruktbare diskusjoner.
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
laser puller | Sutter | P2000/F | |
magnet bar 2×5 mm | Merck | Z283819 | |
MeOH | Merck | 1.06018 | |
microspatula | Merck | Z193216 | |
PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
vortex | BioSan | V-1plus | |
Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |