Her præsenterer vi en protokol til den optimerede FlashPack kapillær kolonne pakning procedure. Anvendelse af en optimeret protokol til en fælles 100-bar trykbombe setup giver mulighed for 10 gange hurtigere pakning og fremstilling af lange ultra-højtydende kapillær kolonner.
Kapillær ultrahøjtydende flydende kromatografi (UHPLC) er i øjeblikket en valgfri metode til prøveadskillelsestrinnet i LC-MS-baserede proteomics. Kapillær kolonner er dog langt mindre robuste i forhold til deres højere flowtællertyper. På grund af nem forurening og blokering har de ofte brug for udskiftning. Det gør dem til en markant dyr del af de samlede LC-MS-analyseomkostninger. Intern pakning af UHPLC kapillær kolonner sparer en masse penge og giver mulighed for tilpasning. Standardpakningsproceduren i trykbomben på 100 bar fungerer dog kun godt for HPLC-kolonner, men er for langsom til UHPLC-sorbenter. Her giver vi en beskrivelse af en optimeret FlashPack-protokol, der anvendes på den samme 100-bar trykbombeopsætning. Metoden er baseret på pakning fra ultrahøj sorbentkoncentrationsstør og er udviklet til intern fremstilling af UHPLC kapillærsøjler af ubegrænset længde i rimelig tid.
Moderne proteomics er baseret på flydende kromatografi-koblet massespektrometri med den ultrahøjtydende nanostrømskromatografi (50-150 μm kolonne intern diameter (ID)) adskillelse, der giver den bedste analysehastighed og følsomhed1. Mens mange kommercielle UHPLC kapillær kolonner er tilgængelige, deres pris udgør en stor del af forbrugsstoffer omkostninger, især når flere forskellige projekter køres i laboratoriet og projekt-specifikke kolonne forurening er et hyppigt problem. Desuden giver pakning af kolonner internt mulighed for brug af brugerdefinerede eksperimentspecifikke sorbenter (f.eks. polyCAT-A sorbent2) og kolonneegenskaber, der ikke er tilgængelige til køb som en færdig kolonne.
For at klare det pakker mange laboratorier kapillærsøjler internt. Den almindelige pakningsprocedure med en trykbombe på 100 bar (trykindsprøjtningscelle)3 er imidlertid uegnet til UHPLC-kolonnepakningen på grund af højt rygtryk på sub-2 μm UHPLC-sorbenter, hvilket resulterer i en dramatisk pakningssatsreduktion sammenlignet med større HPLC-sorbenter. Mens korte UHPLC kolonner stadig kan være meget langsomt pakket, fremstilling af lange UHPLC kolonner er fysisk umuligt4.
Standard kapillær kolonne pakning sker ved relativt lavt tryk-op til 100 barer, og med en meget lav sorbent gylle koncentration. Derfor er to mulige retninger for fremskyndelse af processen tilgængelige. Det er muligt at øge pakningstrykket5. Dette kræver dog specielt udstyr og praktisk talt installation af en ny metode i laboratoriet. En anden måde er at øge sorbent gyllekoncentrationen6. Høj sorbent gyllekoncentrationspakning er beskrevet i kombination med ultrahøjt emballagetryk i en tidligere publikation7. Men ved 100 bartryk, som bruges i de fleste af de eksisterende pakkebomber, resulterer højere sorbentkoncentration i enten pakningshastighed langsommere eller direkte pakningsstop. Effekten blev for nylig vist sig at skyldes sorbent klyngedannelse ved kolonneindgangen, og et simpelt trick af sorbent kuppel destabilisering ved at hamre kolonneindgangen med en magnetbjælke inde i et sorbent hætteglas blev foreslået4. Den resulterende metode, der hedder FlashPack, bruger den samme 100-bar trykbombe pakning setup. Samtidig tillader mindre, men kritiske ændringer i pakningsproceduren pakning fra meget høj sorbent gyllekoncentration og produktion af meget lange UHPLC-kolonner (50 til 70 cm og længere) på mindre end en time, mens en kort kolonne kan produceres på få minutter med separationskvaliteten svarende til kommercielle kolonner af samme parametre4. FlashPack-tilgangen blev allerede anvendt med succes i flere proteomics-projekter til udarbejdelse af både omvendt fase (RP)8,9,10,11,12,13,14 og hydrofil interaktion (HILIC)2 kapillærkolonner.
Her beskriver vi i detaljer de ændringer, der er nødvendige for tilpasning af FlashPack-tilgangen til standard 100-bar trykbombepakningsproceduren.
In-house kapillær kolonne pakning er meget populær i store laboratorier, der arbejder på flere uafhængige projekter. En almindelig pakkemetode fra en lav koncentration sorbent suspension har store begrænsninger i hastigheden og er ude af stand til at producere lange UHPLC kolonner.
FlashPack er en ændring af standardpakningsproceduren, som gør pakning fra en meget høj sorbentkoncentration mulig. Det teoretiske grundlag for metoden ligger i den kontinuerlige sorbent kuppel destabilisering ved kolonneindgangen for hele pakningsvarigheden. Sidstnævnte opnås teknisk ved kolonneindgang, der kontinuerligt rammes med en magnetstang. Metoden til kup destabilisering er bevidst udviklet til at have pakning setup helt ligner den fælles pakning proces, men tricket med FlashPack ligger i detaljerne i sorbent gylle forberedelse, kapillær positionering, og magnet bar brug under pakningsprocessen.
Sorbent gyllen fremstilles som et sedimentsparnelag i et stort opløsningsmiddelvolumen. Det er interessant, at trykbombebaseret pakning ikke kræver de samme pakningsbetingelser for kolonne til kolonne. I FlashPack kender vi aldrig den nøjagtige sorbent gyllekoncentration omkring kolonneindgangen. Det er umuligt at måle og kontrollere nøjagtigt, da det også ændres under pakningsprocessen. De sidste kolonner er dog stadig meget reproducerbare4, uanset hvordan pakningen blev opnået.
Grundlaget for den hurtige pakning ligger i den effektive sorbent kuppel destabilisering. Af denne grund er det vigtigt at kontrollere sorbent ind i kapillæren og opretholde de optimale kuppel destabiliseringsforhold gennem hele pakningsvarigheden. Der er flere mulige problemer, der kan forhindre effektiv sorbent levering. Nogle eksempler på disse er sorbent lag resuspension ved hurtig magnetisk bar rotation, ineffektiv kup destabilisering på grund af enten forkert relativ kapillær til magnet bar positionering eller for langsom magnet bar rotation. Spørgsmålene selv, og hvordan de skal behandles, drøftes i detaljer i protokolafsnittet.
Når kolonnen er pakket, er den overordnede kolonneparameter, der skal kontrolleres, kolonneryggetrykket. Trykværdierne i tabel 5 er et referencepunkt for, hvad der forventes for en af de populære sub 2 μm perlestørrelse sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Samtidig kan yderligere tilbagetryk tilføjes af frit eller en for snævert trukket udleder, og man bør konstant overvåge for det. Hvis pakning sker i en trukket udleder, foreslår vi stadig at måle det forventede kolonne backpressur for den særlige sorbent i brug ved at pakke fritted kapillærer først, og derefter for at se, om den selvmontering frit tilføjer for meget. I forbindelse med problemer med højtryk kan du bruge retningslinjerne i tabel 1 til at identificere problemet.
Det er vores erfaring, at en pakket kolonne uden misfarvninger, huller og med det rette rygtryk fungerer i 100% af tilfældene og giver adskillelseskvaliteten tæt på, hvad der kan forventes fra kolonnelængden og sorbentegenskaberne. En kolonne med misfarvninger er ikke garanteret at fungere korrekt, men kan stadig give tilfredsstillende resultater.
Det meste af tiden, hvis der er problemer med adskillelseskvaliteten, kommer de ikke fra kolonnen selv, men snarere fra andre dele af separationssystemet, nemlig pumper, opløsningsmidler eller forbindelser. Særligt potentielt skadeligt er eventuelle forbindelser efter kolonnen. Dårlig forbindelse med en død volumen mellem emitter og fritted kolonne fører til større peak udvidelse og tailing på grund af meget lave flowhastigheder i kapillær kromatografi.
Et mere vigtigt spørgsmål, der er specifikt for FlashPack-tilgangen, er, at den bruger mange dyre sorbenter i et fungerende sorbent gylleglas. Husk, at sorbent gyllen i FlashPack er beregnet til flere brug. Pas sorbent. Undgå unødvendig magnetstang omrøring for at reducere sorbent slibning-husk at stoppe rotationen, så snart pakningen er færdig. Og lad ikke det åbne sorbent hætteglas i trykbomben for at undgå sorbenttørring. Selvom sorbent stadig kan bruges efter det, tager det tid at genskabe sorbent gyllen.
Metoden fungerer lige så godt for både fritted kapillærer og pulled-emitter kapillærer. FlashPack-princippet øger pakkehastigheden for kapillær-id’er fra 20 til 250 μm (mindre og større blev ikke testet). Det gælder også for alle sorbenter, både fuldt og overfladisk porøs, vi kunne teste (hvilket afspejler, at sorbent cupola dannelse i høj sorbent gylle koncentration ikke er begrænset specifikt til RP sorbents). Desuden påvirker opløsningsmiddelparametrene tydeligt pakningen i henhold til deres fysiske og kemiske egenskaber. For eksempel giver mindre tyktflydende acetone endnu højere pakningshastighed end methanol ved samme pakningstryk. Men det er også mindre polar end methanol og reducerer sorbentpartikler, der klæber til hinanden. Effekten i sig selv forhindrer sorbent cupola dannelse i begyndelsen af pakningen, når flowrate er stadig høj. Reduktion i sorbent partikelinteraktion fører dog også til mindre pålidelig selvmontering af fritdannelse og hyppigere blokering af trukket ende under pakningen. Så mens acetone er bedre til pakning af fritted kapillærer, det er mindre egnet til pulled-emitter kapillærer, med methanol som en gylle opløsningsmiddel er langsommere, men velegnet til begge typer af slutter. Pakning fra hexan eller dichlormethan (DCM) er ekstreme tilfælde af at skifte til acetone fra methanol: de er endnu mindre polare, så de forhindrer sorbent kuppelformation helt, men de er slet ikke egnede til pulled-emitter pakning. Desuden blev det bemærket, at ekstremt lav DCM polaritet fører til sorbent partikler klæber til den interne kapillær væg og gøre et tykt lag på det. Lagtykkelsen vokser gradvist, og tilfældige lokale blokke dannes, hvilket resulterer i kolonnen pakket i flere dele adskilt af regioner uden sorbent. En sådan virkning blev observeret for C18 Peptid Aeris sorbent.
Et andet observeret problem var YMC Triart C18 sorbent ikke suspenderes i methanol ordentligt, men at danne en slags flager. Det forhindrer det dog ikke i at blive pakket med FlashPack og give meget anstændig separationseffektivitet (ikke-offentliggjorte data). Selvom methanol ikke var optimal i nogle tilfælde, var det det mest universelle opløsningsmiddel til at arbejde for alle de testede sorbenter og kolonner. Det er nødvendigt at nævne, at vi endnu ikke har analyseret, hvordan forskellige gylleopløsningsmidler påvirker kolonneseparationens effektivitet. Samtidig er effektiviteten af kolonner pakket fra methanol allerede helt lig med kommercielle kolonner for de samme sorbenter4.
FlashPack er ikke den eneste eksisterende tilgang til at forbedre pakningshastigheden for UHPLC-kolonner. Hurtig pakning fra høj sorbent gyllekoncentration er også mulig ved brug af ultrahøjtrykspakning7. Fordelen ved FlashPack er, at det er meget enklere, da det ikke kræver særlige ultra-højtrykspumper og trykbomber til sorbent levering og kapillærforbindelser. Samtidig blev det påvist, at kolonnerne pakket ved ekstreme tryk kan have adskillelse effektivitet højere end lavere tryk pakket kolonner17. Og mens FlashPack producerer kolonner, der er identiske med kommercielle, der bruges i sammenligningen4, for hvilke vi ikke kender pakkemetoden, blev det endnu ikke testet, hvordan FlashPack-kolonner står mod ultrahøjtrykspakkede kolonner.
Sammenfattende kan den beskrevne FlashPack-metode nemt tilpasses den eksisterende pakkeprotokol i laboratoriet med nogle justeringer af protokollen, mens opsætningen forbliver helt den samme. Det fremskynder HPLC kapillær kolonne pakning til minutter tid og tillader produktion af lange UHP kapillær kolonner, hvilket er klart umuligt med standard pakning procedure. Den samlede økonomi i tid og penge til laboratoriet ved anvendelse af FlashPack-tilgangen kan tælles i titusindvis af euro om året. Derudover åbner muligheden for at producere UHP kapillær kolonner lokalt mulighederne for eksperiment tilpasning umuligt med de tilgængelige kommercielle produkter.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev støttet af RSF tilskud 20-14-00121. Forfatterne takker P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) for frugtbare diskussioner.
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
laser puller | Sutter | P2000/F | |
magnet bar 2×5 mm | Merck | Z283819 | |
MeOH | Merck | 1.06018 | |
microspatula | Merck | Z193216 | |
PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
vortex | BioSan | V-1plus | |
Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |