Method Article

Vitro ve Omurilikte Floresan Etiketli Küçük Hücre Dışı Veziklin Alımı

DOI:

10.3791/62537

⸱

May 23rd, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajdan türetilmiş küçük hücre dışı vesikleleri PKH boyalarla etiketlemek ve intratekal doğumdan sonra in vitro ve omurilikte alımlarını gözlemlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük hücre dışı veziklinler (sEV' ler) tüm hücreler tarafından salgılanan ve vücut sıvılarında bulunan 50-150 nm veziklinlerdir. SEV'ler RNA, proteinler ve lipitler gibi biyomolekülleri donörden alıcı hücrelere aktararak hücreler arasında anahtar sinyal verici arabulucular haline getirir. Merkezi sinir sisteminde (CNS), sEV'ler nöroimmün etkileşimler de dahil olmak üzere hücreler arası sinyalizasyona aracılık edebilir. sEV fonksiyonları, alıcı hücrelerde hem in vitro hem de in vivoolarak etiketli sEV'lerin alımını izleyerek incelenebilir. Bu makalede, RAW 264.7 makrofaj hücrelerinin koşullandırılmış ortamlarından SEV'lerin PKH membran boyası kullanılarak etiketlenerek etiketlenimi açıklanmaktadır. Nöro-2a hücreleri ve birincil astrosit in vitro tarafından birden fazla zaman noktasında etiketli sEV'lerinfarklı konsantrasyonlarının alımını gösterir. Ayrıca fare omurilik nöronlarında, astrositlerde ve konfokal mikroskopi ile görselleştirilen mikroglialarda intratekal olarak teslim edilen sEV'lerin alımı gösterilmiştir. Temsili sonuçlar, sEV'lerin farklı hücreler tarafından alınmasında zamana bağlı varyasyonu göstermektedir, bu da omuriliğe başarılı sEV'lerin teslimini doğrulamaya yardımcı olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük hücre dışı veziklinler (sEV'ler) 50-150 nm boyut aralığına sahip nanosized, membran türevi veziklinlerdir. Çok araçlı cisimlerden (MVB' ler) kaynaklanırlar ve MVB'lerin plazma zarı ile füzyonu üzerine hücrelerden salınırlar. sEV'ler miRNA'lar, mRNA'lar, proteinler ve biyoaktif lipitler içerir ve bu moleküller hücreler arasında hücreden hücreye iletişim şeklinde aktarılır. sEV'ler alıcı hücreler tarafından çeşitli endosit yollar tarafından içselleştirilebilir ve sEV'lerin alıcı hücreler tarafından bu şekilde yakalanması, hem EV'lerdeki hem de hedef hücrelerdeki yüzey moleküllerinin tanınması ile aracılık eder1.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm prosedürler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu'na uygun olarak gerçeklatılmış ve Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Zamanlanmış hamile CD-1 fareler astrositik kültür için kullanıldı ve tüm barajlar emprenye edildikten 15 gün sonra alındı. In vivo alım deneyleri için 10-12 haftalık C57BL/6 fareler kullanıldı.

1. SEV'lerin RAW 264.7 makrofaj hücrelerinden yalıttırılır

  1. Kültür RAW 264.7 hücre 75 cm2 şişelerde DMEM ekzozom-tükenmiş ortamda% 10 ekzozom tükenmiş fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEV'lerin RAW 264.7 şartlandırılmış ortamdan santrifüjleme yoluyla izole edilmesi sonrasında, saflaştırılmış SEV'lerin konsantrasyonunu ve boyut dağılımını belirlemek için NTA kullanılmıştır. RAW 264.7 türevi sEV'lerin ortalama ortalama büyüklüğü 140 nm ve tepe parçacık boyutu 121.8 nm idi ve ışık saçılma ölçümündeki çoğu tespit edilebilir parçacığın 50-150 nm'de ekzozom veya sEV boyut aralığına düştüğünü doğruladı (Şekil 1A). Hücre dışı veziklin çalışmaları için minimum bilgide önerildiğini.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde SEV'lerin PKH boyalarla etiketlenmesi ve omurilikteki alımlarının görselleştirilmesini gösterdik. PKH lipofilik floresan boyalar, akış sitometrisi ve floresan mikroskopi 3 , 5 ,6,12,24,25ile hücreleri etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Nispeten uzun yarı ömürleri ve düşük sitotoksiklikleri nedeniyl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH NINDS R01NS102836 ve Seena K. Ajit'e verilen Pennsylvania Sağlık Bakanlığı Commonwealth Evrensel Araştırma Geliştirme (CURE) hibeleri ile desteklenmiştir. Dr. Bradley Nash'e makaleyi eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon Ultra 0.5 mL santrifüj filtrelerMilliporeSigmaZ677094
Anti-Alix AntikoruAbcamab1864291:1000
Anti-Calnexin AntikoruAbcamAb102861:1000
Anti-CD81 AntikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-1660291:1000
Anti-GAPDH Monoklonal Antikor (14C10)Hücre Sinyali Teknoloji21181:1000
Anti-glial Fibriler asidik protein antikoruSigma-AldrichMAB360IF için 1:500; IHC
Anti-Iba1 AntikoruWako019-197411:2000
Anti-MAP2A AntikoruSigma-AldrichMAB3781:500
Sığır Serum Albümini (BSA)VWR0332
Hücre Süzgeci, 40 μ mVWR15-1040-1
Santrifüj TüpleriThermo Scientific3118-005012.000 x g
Lamel, 12 mm, #1.5 ElektronMikroskobu Bilimleri72230-01
Lamel, 18 mm, #1.5Elektron Mikroskobu Bilimleri72222-01
DAPISigma-AldrichD9542-1MG1 &mikro; g/mL
DC Protein TestiBio-Rad500-0116
Deoksiribonükleaz I (DNAse I)MilliporeSigmaD4513-1VL
Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (HRP)Abcamab162841:10000
Eşek Anti-Tavşan IgG H& L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-212061:500
Çift Buzlu Mikroskop Slaytları, #1Thermo Scientific12-552-5
Kalsiyum ve MagnezyumCorning Corning21-031-CV
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)Corning10-013-CV
Eksozom Tükenmiş Fetal Sığır SerumuGibcoA27208-01
Fetal Sığır Serumu (FBS)Corning35-011-CV
FluorChem M görüntüleme sistemiProteinSimple
FV3000 Konfokal MikroskopOlympus
Keçi Anti-Fare IgG H & L (HRP)Abcamab67891:10000
Keçi Anti-Fare IgG H & L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110011:500
Keçi Anti-Fare IgG1, Alexa Fluor 594InvitrogenA-211251:500
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)VWR02-0121
HEPESGibco15630080
HRP SubstratThermo Scientific34094
Kesişme engelleme tamponu, TBSLI-COR Biosciences927-60001
Laemmli SDS Numune TamponuAlfa AesarAAJ61337AC
Mikro Kapak Camı, #1VWR48404-454
Microm HM550Thermo Scientific
NanoSight NS300 sistemiMalvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 yazılımıMalvern Panalytical
Nöro-2a Hücre HattıATCCCCL-131
Normal Keçi SerumuVektör LaboratuvarlarıS-1000
OCT BileşiğiSakura Finetek4583
PapainWorthington Biyokimya ŞirketiNC9597281
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri19210
Penisilin-StreptomisinGibco15140122
PKH26Sigma-AldrichMINI26-1KT
PKH67Sigma-AldrichMINI67-1KT
Proteaz İnhibitörü KokteyliThermo Scientific1862209
PVDF Transfer MembranıMDISVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Hücre HattıATCCTIB-71
RIPA TamponSigma-AldrichR0278
Sodyum KlorürAMRESCO0241-2.5KG
Superfrost Plus Altın SlaytlarThermo Scientific15-188-48yapışkan slaytlar
T-75 ŞişelerCorning431464U
Tecnai 12 Dijital Transmisyon Elektron MikroskobuFEI Şirketi
TEM Izgaraları ElektronMikroskobu BilimleriFSF300-cu
Tris-Glisin Protein Jeli,% 12İnvitrojenXP00120BOX
Tris-Glisin SDS Çalışan TamponİnvitrojenLC26755
Tris-Glisin Transfer TamponuİnvitrojenLC3675
TrypLE ExpressGibco12605028hücre ayrışma enzimi
Triton X-100Acros Organics327371000
Tripsin, %0,25Corning25-053-CL
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Ultrasantrifüj TüpleriBeckman344058110.000 x g
için 1:1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).
  2. Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in viv....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Small Extracellular VesiclesSEV UptakeFluorescent LabelingSpinal CordConfocal MicroscopyNeuro 2a CellsPrimary AstrocytesIntrathecal DeliveryWestern BlotBiomolecular Cargo Transfer

Related Articles