माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के भीतर 3डी संगठित मानव हृदय ऊतक का विकास
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य कार्डियक इंजीनियरिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग में अनुप्रयोगों के लिए बायोमिमेटिक, कोलेजन आधारित हाइड्रोजेल के भीतर, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट (सीएफएफ) के साथ स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स सह-सुसंस्कृत स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स से बना अत्यधिक गठबंधन मानव हृदय ऊतक के त्रि-आयामी (3 डी) माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल के विकास को समझाना और प्रदर्शित करना है।
Abstract
दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण हृदय रोग (सीवीडी) के रूप में बनी हुई है । हालांकि, दिल की मांसपेशियों की शारीरिक और जैविक जटिलता, मायोकार्डियम मॉडलिंग, विट्रो में पूरा करने के लिए बेहद मुश्किल है। मुख्य रूप से, बाधाएं मानव कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) की आवश्यकता में होती हैं जो या तो वयस्क हैं या वयस्क की तरह फेनोटाइप प्रदर्शित करती हैं और मायोकार्डियम की सेलुलर जटिलता और जटिल 3 डी वास्तुकला को सफलतापूर्वक दोहरा सकती हैं। दुर्भाग्य से, नैतिक चिंताओं और उपलब्ध प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न मानव हृदय ऊतक की कमी के कारण, सीएम के ंयूनतम प्रसार के साथ संयुक्त, व्यवहार्य मानव सीएम की सोर्सिंग हृदय ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक सीमित कदम रहा है । इस उद्देश्य के लिए, अधिकांश शोध मानव सीपीएम के प्राथमिक स्रोत के रूप में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) के हृदय भेदभाव की ओर संक्रमण है, जिसके परिणामस्वरूप हृदय ऊतक मॉडलिंग के लिए विट्रो परख में के भीतर hiPSC-CMs के व्यापक समावेश में जिसके परिणामस्वरूप ।
यहां इस काम में, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर 3 डी परिपक्व स्टेम सेल-व्युत्पन्न मानव हृदय ऊतक विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। हम विशेष रूप से समझाते हैं और नेत्रहीन एचआईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम से 3 डी इन विट्रो एनिसोट्रोपिक कार्डियक टिश्यू-ऑन-ए-चिप मॉडल के उत्पादन को प्रदर्शित करते हैं। हम मुख्य रूप से सीएम के लिए चयन करने के लिए एक शुद्धि प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, मानव सीएफएस (एचसीएफ) के साथ सीएम को मिलाने के माध्यम से एक परिभाषित अनुपात के साथ कोशिकाओं की सह-संस्कृति, और कोलेजन-आधारित हाइड्रोगेल के भीतर इस सह-संस्कृति का निलंबन। हम आगे हमारे अच्छी तरह से परिभाषित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर सेल से लदे हाइड्रोगेल के इंजेक्शन को प्रदर्शित करते हैं, जो कंपित अंडाकार माइक्रोपोस्ट के साथ एम्बेडेड होते हैं जो आसपास की कोशिकाओं और हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के संरेखण की उच्च डिग्री को प्रेरित करने के लिए सतह स्थलाकृति के रूप में काम करते हैं, जो देशी मायोकार्डियम की वास्तुकला की नकल करते हैं। हम कल्पना करते हैं कि प्रस्तावित 3डी एनिसोट्रोपिक कार्डियक टिश्यू-ऑन-चिप मॉडल मौलिक जीव विज्ञान अध्ययन, रोग मॉडलिंग और स्क्रीनिंग टूल, फार्मास्यूटिकल परीक्षण के रूप में इसके उपयोग के माध्यम से उपयुक्त है।
Introduction
ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण व्यापक रूप से पता लगाया गया है, हाल के वर्षों में, पुनर्योजी दवा और रोग मॉडलिंग1,2में वीवो नैदानिक निष्कर्षों में साथ । मानव प्राथमिक हृदय ऊतक सोर्सिंग और विट्रो सरोगेट्स में शारीरिक रूप से प्रासंगिक उत्पादन में अंतर्निहित कठिनाइयों के कारण इन विट्रो कार्डियक ऊतक मॉडलिंग पर विशेष जोर दिया गया है, हृदय रोगों (सीवीडी)1,3के जटिल तंत्र की मौलिक समझ को सीमित करता है। पारंपरिक मॉडलों में अक्सर 2D मोनोलेयर संस्कृति परख शामिल होती है। हालांकि, मायोकार्डियम और जटिल सेलुलर इंटरैक्शन के देशी परिदृश्य की नकल करने के लिए 3 डी वातावरण के भीतर हृदय कोशिकाओं को बनाने के महत्व को बड़े पैमाने पर4,5की विशेषता दी गई है। इसके अतिरिक्त, इस प्रकार अब तक उत्पादित अधिकांश मॉडलों में स्टेम सेल से विभेदित सीएम की मोनो-संस्कृति शामिल है। हालांकि, दिल में एक जटिल 3 डी आर्किटेक्चर7 के भीतर कई सेल प्रकार6शामिल हैं, जो देशी मायोकार्डियम के सेलुलर घटकों की बेहतर नकल करने के लिए 3 डी इन विट्रो मॉडल के भीतर ऊतक संरचना की जटिलता में सुधार करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता को वारंट करते हैं।
आज तक, मायोकार्डियम 8 के बायोमिमेटिक 3डी मॉडल का उत्पादन करने के लिए कई अलग-अलगदृष्टिकोणोंका पता लगाया गया है। ये दृष्टिकोण प्रायोगिक सेटअप से लेकर होते हैं जो उत्पन्न बल की वास्तविक समय गणना के लिए अनुमति देते हैं, मोनो-कल्चर सीएमएस से पतली फिल्मों (डीम्ड मस्कुलर पतली फिल्मों (एमटीएफ))9पर वरीयता प्राप्त, 3 डी हाइड्रोगेल मैट्रिस में सह-संस्कृति हृदय कोशिकाओं को मुक्त-खड़े कैंटिलीवर्स (डीम्ड इंजीनियर हार्ट ऊतक (ईएचटी)10के बीच निलंबित कर दिया गया है। अन्य दृष्टिकोणों ने एक ऊतक पैच11में माइक्रोपोस्ट फैलाने के बीच निलंबित 3 डी हाइड्रोजेल में मोनो-कल्चर सीएम से मायोकार्डियल एनिसोट्रोपी की नकल करने के लिए माइक्रोमोल्डिंग तकनीकों को लागू करने पर ध्यान केंद्रित किया है, जो इंडेंट माइक्रोग्रूव्स12,13के बीच वरीयता प्राप्त मोनो-कल्चर सीएम को है। इन तरीकों में से प्रत्येक के लिए अंतर्निहित फायदे और नुकसान हैं, इसलिए, इच्छित आवेदन और संबंधित जैविक प्रश्न के साथ संरेखित तकनीक का उपयोग करना प्रासंगिक है।
स्टेम सेल-व्युत्पन्न सीएम की परिपक्वता को बढ़ाने की क्षमता वयस्क की तरह मायोकार्डियल ऊतक की इन विट्रो इंजीनियरिंग में सफल और नैदानिक व्याख्याओं के लिए बाद के निष्कर्षों के अनुवाद के लिए आवश्यक है । इस उद्देश्य के लिए, 2डी और 3 डी14, 15, 16दोनों में परिपक्व सीएम के तरीकों का व्यापक रूप से पता लगाया गया है। उदाहरण के लिए, ईएचटी में शामिल विद्युत उत्तेजना, सतह स्थलाकृति के साथ सीएम के जबरन संरेखण, संकेत संकेत, सह-संस्कृति से विकास कारक, और/या 3 डी हाइड्रोजेल स्थितियां, आदि, सभी निम्नलिखित में से कम से एक में सीएम परिपक्वता के पक्ष में परिवर्तन का कारण बनते हैं: सेल आकृति विज्ञान, कैल्शियम हैंडलिंग, सारकोमिक संरचना, जीन अभिव्यक्ति, या अनुबंध बल ।
इन मॉडलों में से, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों का उपयोग करने वाले दृष्टिकोण प्रकृति में कुछ लाभों को बनाए रखते हैं, जैसे कि ग्रेडिएंट का नियंत्रण, सीमित सेल इनपुट, और न्यूनतम आवश्यक अभिकर्मक। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों का उपयोग करके कई जैविक प्रतिकृतियां उत्पन्न की जा सकती हैं, जो ब्याज के जैविक तंत्र को बेहतर ढंग से विच्छेदन करने और सांख्यिकीयशक्ति17, 18,19के पक्ष में प्रयोगात्मक नमूना आकार को बढ़ाने के लिए सेवारत हैं। इसके अतिरिक्त, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस फैब्रिकेशन प्रक्रिया में फोटोलिथोग्राफी का उपयोग करने से सूक्ष्म और नैनो-स्तर पर सटीक विशेषताओं (जैसे, स्थलाकृति) का निर्माण होता है, जो ऊतक उत्थान और रोग मॉडलिंग में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए आसपास की सेलुलर संरचना और मैक्रो-स्तरीय ऊतक वास्तुकला18,20,21,22 को बढ़ाने के लिए मेसोस्कोपिक संकेतों के रूप में काम करते हैं।
हमने पहले एक उपन्यास 3 डी कार्डियक ऊतक ऑन-चिप मॉडल के विकास का प्रदर्शन किया जो सतह की स्थलाकृति को जन्मजात अंडाकार माइक्रोपोस्ट के रूप में शामिल करता है, हाइड्रोगेल-एन्कैप्सेटेड सह-संस्कारी हृदय कोशिकाओं को एक परस्पर, एनिसोट्रोपिक ऊतक20में संरेखित करने के लिए। संस्कृति के 14 दिनों के बाद, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर बनने वाले ऊतक मोनोलेयर और 3 डी आइसोट्रोपिक नियंत्रण23की तुलना में अपने फेनोटाइप, जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, कैल्शियम हैंडलिंग विशेषताओं और दवा प्रतिक्रिया में अधिक परिपक्व होते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में हाइप्ससी-व्युत्पन्न सीएम का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर इस 3 डी सह-संस्कारी, गठबंधन (यानी, एनिसोट्रोपिक) मानव हृदय ऊतक बनाने की विधि को रेखांकित किया गया है। विशेष रूप से, हम सीएम के प्रति एचआईपीसी को अलग करने और शुद्ध करने के तरीकों की व्याख्या करते हैं, एक स्थापित सह-संस्कृति आबादी का उत्पादन करने के लिए सीएम के साथ एचसीएफ की पूरकता, कोलेजन हाइड्रोगेल के भीतर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में समझाया गया सेल आबादी का सम्मिलन, और अनुबंध और इम्यूनोफ्लोर्सेंट परख के माध्यम से 3 डी निर्मित ऊतकों का बाद में विश्लेषण। परिणामी 3डी इंजीनियर माइक्रो-ऊतक विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं, जिनमें मौलिक जीव विज्ञान अध्ययन, सीवीडी मॉडलिंग और दवा परीक्षण शामिल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
उन्नत सेल-सेल इंटरैक्शन और बायोमिमेटिक 3 डी संरचना के साथ इन विट्रो मानव हृदय ऊतक मॉडल का गठन बुनियादी हृदय अनुसंधान और इसी नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक है1। यह उल्लिखित प्रोटोकॉल एक ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एनएसएफ कैरियर पुरस्कार #1653193, एरिजोना बायोमेडिकल रिसर्च कमीशन (एबीआरसी) नए अन्वेषक पुरस्कार (ADHS18-198872) और इस परियोजना के लिए धन स्रोत प्रदान करने के लिए Flinn फाउंडेशन पुरस्कार का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । HIPSC लाइन, SCVI20, जोसेफ सी वू, एमडी, स्टैनफोर्ड हृदय NIH R24 HL117756 द्वारा वित्त पोषित संस्थान में पीएचडी से प्राप्त किया गया था । एचआईपीएससी लाइन, IMR90-4, WiCell अनुसंधान संस्थान55, 56से प्राप्त किया गया था।
Materials
| 0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
| 1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
| 1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
| 18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
| 6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
| B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
| B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
| CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
| DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
| DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
| E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
| EDTA | VWR | 45001-122 | |
| Ethanol | |||
| FGM3 | VWR | 10172-048 | |
| GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
| Glycine | Sigma | G8898-500G | |
| Goat serum | VWR | 10152-212 | |
| hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
| IPA | |||
| IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
| Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
| MTCS | Sigma | 440299-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
| Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
| Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
| RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
| Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
| Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
| SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
| Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
| T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| EVG620 Aligner | EVG | ||
| Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
| Leica SP8 Confocal microscope | Leica |
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