Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/62539
Automatic Translation
1, 1,2
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 2Biodesign Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג'ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.

Abstract

הגורם המוביל למוות ברחבי העולם נמשך כמו מחלות לב וכלי דם (CVD). עם זאת, דוגמנות המורכבות הפיזיולוגית והביולוגית של שריר הלב, שריר הלב, הוא ידוע לשמצה קשה להשיג במבחנה. בעיקר, מכשולים טמונים הצורך קרדיומיוציטים אנושיים (CMs) כי הם מבוגרים או להפגין פנוטיפים דמויי מבוגרים והוא יכול לשכפל בהצלחה את המורכבות התאית של שריר הלב וארכיטקטורה 3D מורכב. למרבה הצער, בשל חששות אתיים וחוסר זמין ראשוני נגזר רקמת לב אנושית, בשילוב עם התפשטות מינימלית של CMs, המקור של CMs אנושי קיימא כבר צעד מגביל עבור הנדסת רקמת לב. לשם כך, רוב המחקרים עברו לבידול לבבי של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (hiPSCs) כמקור העיקרי של CMs אנושיים, וכתוצאה מכך התאגדות רחבה של hiPSC-CMs בתוך מבחני חוץ למידול רקמת לב.

כאן בעבודה זו, אנו מדגימים פרוטוקול לפיתוח רקמת לב אנושית בוגרת תלת מימדית שמקורה בתאי גזע בתוך מכשיר מיקרופלואידי. אנו מסבירים באופן ספציפי ומדגימים ויזואלית את הייצור של מודל רקמת לב אניסוטרופית במבחנה במבחנה על שבב מ- CMs שמקורם ב- hiPSC. אנו מתארים בעיקר פרוטוקול טיהור לבחירה עבור CMs, תרבות משותפת של תאים עם יחס מוגדר באמצעות ערבוב CMs עם CFs אנושיים (hCFs), והשעיה של תרבות משותפת זו בתוך הידרוג'ל מבוסס קולגן. אנו מדגימים עוד יותר את ההזרקה של הידרוג'ל עמוס התאים בתוך המכשיר המיקרופלואידי המוגדר היטב שלנו, משובץ במיקרופוסטים אליפטיים מתנדנדים המשמשים כטופוגרפיה של פני השטח כדי לגרום ליישור גבוה של התאים שמסביב ומטריצת ההידרוגל, מחקה את הארכיטקטורה של שריר הלב המקומי. אנו צופים כי מודל הרקמה-על-שבב של הלב הדו-ממדי המוצע מתאים למחקרי ביולוגיה בסיסיים, דוגמנות מחלות, ובאמצעות השימוש בו ככלי סינון, בדיקות פרמצבטיות.

Introduction

גישות הנדסת רקמות נחקרו בהרחבה, בשנים האחרונות, כדי ללוות ממצאים קליניים vivo ברפואה רגנרטיבית ומידול מחלות1,2. דגש משמעותי הושם במיוחד על מידול רקמת לב במבחנה בשל הקשיים הטבועים במיקור רקמת לב ראשונית אנושית והפקת תחליפים במבחנה רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, המגבילים את ההבנה הבסיסית של המנגנונים המורכבים של מחלות לב וכלי דם (CVDs)1,3. מודלים מסורתיים מעורבים לעתים קרובות 2D monolayer תרבות מבחנים. עם זאת, החשיבות של culturing תאי לב בתוך סביבה 3D לחקות הן את הנוף הטבעי של שריר הלב אינטראקציות הסלולר מורכב התאפיין בהרחבה4,5. בנוסף, רוב הדגמים שיוצרו עד כה כללו מונו-תרבות של CMs המובדלים מתאי גזע. עם זאת, הלב מורכב מסוגי תאים מרובים6 בתוך ארכיטקטורה 3D מורכב7, המצדיק את הצורך הקריטי לשפר את המורכבות של הרכב הרקמה בתוך מודלים 3D במבחנה כדי לחקות טוב יותר מרכיבים הסלולר של שריר הלב המקורי.

עד כה, גישות רבות ושונות נחקרו כדי לייצר מודלים ביומימטיים 3D של שריר הלב8. גישות אלה נעות בין הגדרות ניסיוניות המאפשרות חישוב בזמן אמת של כוח שנוצר, מן CMs מונו-תרבות זרע על סרטים דקים (נחשב סרטים דקים שרירים (MTFs))9, כדי co-culture תאי לב מטריצות הידרוג'ל 3D מושעה בין cantilevers העומדים חופשיים (נחשב רקמות לב מהונדסות (EHTs))10. גישות אחרות התמקדו ביישום טכניקות micromolding לחקות anisotropy שריר הלב, מן CMs מונו-תרבות הידרוג'ל 3D מושעה בין microposts בולטים במדבקת רקמה11, כדי מונו-תרבות CMs זרעים בין microgroovesמוסטים 12,13. ישנם יתרונות וחסרונות מובנים לכל אחת משיטות אלה, ולכן, זה רלוונטי לנצל את הטכניקה התואמת את היישום המיועד ואת השאלה הביולוגית המתאימה.

היכולת לשפר את ההבשלה של תאי גזע נגזר CMs חיוני להנדסת במבחנה מוצלחת של רקמת שריר הלב דמוי מבוגר ותרגום של ממצאים הבאים פרשנויות קליניות. למטרה זו, שיטות כדי בוגרת CMs נחקרו נרחב, הן 2D ו 3D14,15,16. לדוגמה, גירוי חשמלי המשולב ב- EHTs, יישור כפוי של CMs עם טופוגרפיה של פני השטח, רמזי איתות, גורמי גדילה מתרבות משותפת ו/או תנאי הידרוג'ל תלת-ממדיים וכו ', כולם מובילים לשינוי לטובת התבגרות CM לפחות באחת מהאפשרויות הבאות: מורפולוגיה של תאים, טיפול בסידן, מבנה סרקומרי, ביטוי גנים או כוח התכווצותי.

מבין מודלים אלה, הגישות המשתמשות בפלטפורמות מיקרופלואידיות שומרות על יתרונות מסוימים בטבע, כגון שליטה במעברי צבע, קלט תאים מוגבל וריאנטים מינימליים נחוצים. יתר על כן, משכפלים ביולוגיים רבים יכולים להיווצר בבת אחת באמצעות פלטפורמות microfluidic, המשרתים לנתח טוב יותר את המנגנון הביולוגי של עניין ולהגדיל את גודל המדגם הניסיוני לטובת כוח סטטיסטי17,18,19. בנוסף, שימוש בפוטוליטוגרפיה בתהליך ייצור המכשירים המיקרופלואידיים מאפשר יצירת תכונות מדויקות (למשל טופוגרפיות) ברמת המיקרו והננו, המשמשות כרמזים מזוסקופיים לשיפור המבנה התאי שמסביב וארכיטקטורת רקמות ברמת המאקרו18,20,21,22 עבור יישומים שונים בהתחדשות רקמות ומידול מחלות.

הדגמנו בעבר את הפיתוח של מודל חדש של רקמת לב תלת-ממדית על שבב המשלב טופוגרפיה של פני השטח, בצורה של מיקרופוסטים אליפטיים מולדים, כדי ליישר תאי לב מתורבתים הידרוג'ל-אנקפסולציה לתוך רקמה מחוברת, אניזוטרופית20. לאחר 14 ימים של תרבות, הרקמות שנוצרו בתוך המכשיר המיקרופלואידי בוגרות יותר בפנוטיפ שלהם, פרופיל ביטוי גנים, מאפייני טיפול בסידן ותגובה פרמצבטית בהשוואה לבקרות איזוטרופיות חד שכבתיות ותלת-ממדיות23. הפרוטוקול המתואר בזאת מתאר את השיטה ליצירת רקמת לב אנושית מתורבתת תלת-ממדית זו , המיושרת (כלומר, אניזוטרופית) בתוך המכשיר המיקרופלואידי באמצעות CMs שמקורם ב- hiPSC. באופן ספציפי, אנו מסבירים את השיטות כדי להבדיל ולטהר hiPSCs כלפי CMs, תוספת של hCFs עם CMs כדי לייצר אוכלוסיית תרבות משותפת הוקמה, החדרת אוכלוסיית התא עטוף בתוך הידרוג'ל קולגן לתוך התקנים microfluidic, וניתוח הבא של רקמות 3D בנוי באמצעות מבחנים התכווצות immunofluorescent. מיקרו-רקמות מהונדסות תלת-ממד וכתוצאה מכך מתאימות ליישומים שונים, כולל מחקרי ביולוגיה בסיסיים, מידול CVD ובדיקות פרמצבטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בצע את כל הטיפול בתאים והכנת ריאגנט בתוך קבינט Biosafety. ודא שכל המשטחים, החומרים והציוד שבאים במגע עם תאים הם סטריליים (כלומר, לרסס למטה עם 70% אתנול). תאים צריכים להיות בתרבית בחממה לחה 37 °C (60 °F), 5% CO2 חממה. כל תרבות ה-hiPSC והבידול מבוצעים בצלחות של 6 בארות.

1. יצירת מכשיר מיקרופלואידי (משך משוער: שבוע)

  1. פוטוליטוגרפיה
    הערה: המסכה, שתוכננה באמצעות קובץ CAD (מסופק כקובץ משלים 1), מכילה את העיצוב של הערוץ המיקרופלואידי. הדפס את העיצוב על מסיכה שקופה. לאחר מכן, בצע פוטוליטוגרפיה סטנדרטית עם פוטורסיסט שלילי SU8 2075 על רקיק סיליקון 4 אינץ ' בתוך חדר נקי.
    1. לנקות רקיק סיליקון עם אלכוהול איזופרופיל (IPA) ויבש עם חנקן. אופים ב 200 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות להתייבשות.
      הערה: טפל בוופל בפינצטה.
    2. מניחים את הוופל במעיל הספין. הפקדה 3-4 מ"ל של SU8 במרכז הוופל, ואז להסתובב כדי ליצור שכבה של 200 מיקרומטר (כלומר, רמפה עד 15 s כדי 500 סל"ד, להסתובב במשך 10 s, רמפה עד 5 s כדי 1,200 סל"ד, ולסובב במשך 30 s, ואז downspin במשך 15 s עד נעצר).
    3. מוציאים וופל ואופים רכים במשך 7 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, ואז 45 דקות ב-95 מעלות צלזיוס.
    4. מעבירים את הוופל למיישר מסכות ומניחים את המסכה השקופה במחזיק המסכה עם מסנן UV. לחשוף את הוופל ל 2 מחזורים של 230 mJ / cm2, עם עיכוב של 30 s, לחשיפה כוללת של 460 mJ / ס"מ2.
    5. בצעו אפייה לאחר החשיפה על הוופל החשוף בתנור של 50 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    6. כבו את התנור למחרת בבוקר, ואחרי שהוופל התקרר לטמפרטורת החדר, הטביעו אותו במפתח SU8. הסר את הוופל מהמפתח כל 5 דקות ולשטוף עם IPA, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה במפתח.
    7. לאחר כ 20 דקות, או כאשר IPA פועל ברור, לייבש את הוופל עם חנקן אוויר ואופים קשה בתנור להגדיר 150 מעלות צלזיוס; ברגע התנור מגיע 150 מעלות צלזיוס, לכבות אותו אבל לא לפתוח. השאירו את הוופל בתנור עד שיגיע לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו את הוופל.
    8. אשר את הגובה של SU8 עם פרופיל ואת התכונות האופטיות עם מיקרוסקופ אור. לאחר אישור, קלטת הוופל בתוך צלחת פטרי פלסטיק 150 מ"מ.
  2. ליתוגרפיה רכה
    הערה: הוופל, מודבק לצלחת פטרי, צריך להיות silanized כדי למנוע דבקות של PDMS לתכונות SU8.
    1. הפוך את הוופל (טפח לצלחת פטרי פלסטיק) על צלחת פטרי זכוכית באותו גודל המכיל 0.4 מ"ל של מתילטריכלורוסילאן (MTCS) ולחשוף את הוופל לאדים במשך 4 דקות. הופכים את הוופל זקוף ומניחים את המכסה על צלחת הפטרי.
    2. מערבבים 30 גרם של בסיס אלסטומר סיליקון לסוכן הריפוי ביחס של 10:1. מוציאים את המכסה מצלחת הפטרי ויוצקים את הפולידימתילסילוקסן (PDMS) על הוופל, ואז את הגז בתוך מייבש.
    3. לאחר כל הבועות נעלמות, למקם את הוופל ב 80 °C (60 °F) עבור 1.5 שעות כדי לרפא את PDMS.
    4. לקלף בזהירות את PDMS, ו אגרוף כניסת ושקעים עבור יציאות רקמה וערוצי מדיה עם אגרוף ביופסיה 1 מ"מ ו 1.5 מ"מ, בהתאמה.
    5. נקה את ערוצי PDMS באמצעות סרט הדבקה להסרת אבק. לאחר מכן, להשרות את הכיסויים (18 x 18 מ"מ, מס '1) ב 70% אתנול לפחות 15 דקות. לאחר מכן, לייבש אותם עם מגבונים רקמה.
    6. הנח הן את הכיסויים והן את ערוצי PDMS (צד התכונות חשוף) לפלזמה (הגדרה על גבוה) במשך דקה, ואז להתחבר במהירות יחד ומניחים בתנור 80 מעלות צלזיוס לילה כדי להבטיח את הקשר.
      הערה: במהלך מליטה, זה חיוני כדי להפעיל לחץ קל על הקצוות של ערוצי PDMS כדי להבטיח חותם טוב בין PDMS וזכוכית תוך הימנעות הערוץ עצמו כדי למנוע קריסת הערוץ.
  3. הכנת התקן
    1. שקועים בהתקני PDMS מלוכדים במים שעברו דה-יון (DI H2O) ומובלעת אוטומטית עם מחזור הנוזלים. לאחר מכן, לשאוף את הנוזל מן ההתקנים autoclave שוב עם מחזור הכבידה. לאחר מכן, לייבש את המכשירים מעוקרים לילה ב 80 מעלות צלזיוס.

2. תרבות תאי גזע (משך משוער: 1-2 חודשים)

  1. תרבות ותחזוקה של hiPSC
    הערה: hiPSCs צריך להיות תרבותי במשך שלושה קטעים רצופים לאחר הפשרת במבחנה לפני cryopreservation או בידול. hiPSCs מתורבתים במדיום E8 או mTeSR1, בהתאם לקו התאים, על הלוחות מצופים מטריצת קרום המרתף24.
    1. כדי לצפות צלחות עם מטריצת קרום מרתף באיכות hESC, להפשיר aliquot אחד של מדיום המטריצה (נפח תלוי הרבה, בדרך כלל 200-300 μL; מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס) על ידי הוספתו ל 25 מ"ל של DMEM / F-12K על קרח. לוותר 1 מ"ל של השעיה זו לתוך כל באר של צלחת 6-well. השאירו את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 1 שעה.
    2. בעת הפשרה, לשנות את המדיה E8 לתרבות hiPSC על ידי הוספת 5 מיקרומטר של Y-2763225 (E8 +RI). השתמש במדיה זו במשך 24 שעות לאחר מכן ולאחר מכן שנה את המדיה ל- E8 טרי.
      הערה: עבור שינויי מדיה שגרתיים, מדיה E8 ללא שינוי משמשת לתרבות hiPSC. לצורך תחזוקה שוטפת, יש לשנות מדיית E8 מדי יום, כ- 24 שעות לאחר שינוי המדיה הקודם.
    3. תאי מעבר ביום 3 או יום 4, לשאוף מדיה, ולאחר מכן לשטוף כל באר עם 1 מ"ל של 1x פתרון פוספט-אגירה של DPBS.
      הערה: ודא שהתאים הם סביב 70% confluent. אל תתנו להם לגדול מעבר 70% מפגש.
    4. לשאוף את DPBS, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 0.5 מ"מ EDTA לכל באר לדגר בטמפרטורת החדר במשך 6-7 דקות.
    5. בזהירות לשאוף EDTA, להוסיף 1 מ"ל של E8 + RI לתוך כל באר הפיצוץ על פני השטח עם פיפטה 1 מ"ל (~ 5-10 פעמים כדי לאסוף את כל התאים). לאסוף את המתלה התא בצינור microcentrifuge 15 מ"ל.
    6. ספור את השעיית התא והמעבר בצפיפות התא הרצויה (כלומר, ~ 200 K לבאר) ב- E8+RI.
    7. שנה מדיה ל- E8 (ללא RI) 24 שעות לאחר מכן. אל תשאיר את התאים עם RI במשך יותר מ 24 שעות.
      הערה: E8 לא צריך להיות מחומם ל 37 °C (69 °F). תמיד להשאיר אותו בטמפרטורת החדר להתחממות לפני תרבות התא.
  2. בידול מונחה קרדיומיוציטים (CM)
    הערה: חשוב לציין את קיומו של הטרוגניות בין שורות שונות של hiPSCs26,27, ולכן ייתכן שיהיה צורך למטב את השלבים הבאים עבור כל קו תא. בצע את השלבים הבאים לקבלת בידול CM.
    1. הכן RPMI + B27 - אינסולין על ידי הוספת 10 מ"ל של B27 מינוס אינסולין ו 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס) ל 500 מ"ל של RPMI 1640.
    2. הכן RPMI + B27 + אינסולין על ידי הוספת 10 מ"ל של B27 ו 5 מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס ל 500 מ"ל של RPMI 1640.
    3. הכן RPMI מינוס גלוקוז + B27 + אינסולין על ידי הוספת 10 מ"ל של B27, 5 מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס, ו 4 מ"מ נתרן לקטט ל 500 מ"ל של RPMI 1640 ללא גלוקוז.
    4. ברגע hiPSCs להגיע 85% מפגש, להתחיל בידול (יום 0) על ידי החלפת המדיום הישן עם 4 מ"ל של RPMI + B27 - מדיום אינסולין המכיל 10 מיקרומטר CHIR99021 לכל באר של צלחת 6-well (כלומר, להוסיף 25 μL של 10 מ"מ CHIR99021 לתוך 25 מ"ל של RPMI + B27 - אינסולין ולאחר מכן מיד להוסיף 4 מ"ל לבאר).
      הערה: CHIR99021 הוא מעכב GSK ומוביל להפעלת Wnt. הריכוז האופטימלי של CHIR99021 וההתקהלות הראשונית משתנה עבור כל קו תא28. בדוק תמיד שיפוע ריכוז של 6-12 מיקרומטר CHIR99021 וסדרה של צפיפויות זריעה לפני הניסוי בפועל כדי לקבוע תנאים אופטימליים לייזום בידול.
    5. בדיוק 24 שעות מאוחר יותר (יום 1), לשאוף את המדיום ולהחליף עם 5 מ"ל של RPMI מראש + B27 - אינסולין לכל באר.
    6. בדיוק 72 שעות לאחר תוספת CHIR99021 (יום 3), לאסוף 2.5 מ"ל של מדיום בילה מכל באר של צלחת 6-well, בהיקף של 15 מ"ל של מדיום בילה בצינור.
    7. לזה, להוסיף 15 מ"ל של RPMI טרי + B27 - מדיום אינסולין. הוסף IWP2 לריכוז של 5 מיקרומטר לצינור הבינוני המשולב (כלומר, 1 μL של IWP2 ב 5 מ"מ לכל 1 מ"ל של בינוני משולב או 30 μL של IWP2 לתוך 30 מדיה מ"ל הכולל).
    8. הסר ~ 1.5 מ"ל של המדיום הנותר לכל באר של הצלחת, כך 1 מ"ל של המדיום נשאר. מערבולת הצלחת במרץ כדי להבטיח הסרה נאותה של פסולת התא. לאחר מכן, לשאוף את שאר המדיום הישן ולהוסיף 5 מ"ל של המדיום המשולב המכיל IWP2 לכל באר של הצלחת.
      הערה: התוספת של IWP2 לתאים מובילה לעיכוב Wnt.
    9. ביום 5, לשאוף את המדיום מכל באר ולהחליף אותו עם 5 מ"ל של RPMI מראש - B27 - אינסולין.
    10. התבגרות CM: ביום 7, יום 9, ויום 11, לשאוף את המדיום מכל באר ולהחליף אותו עם 5 מ"ל של RPMI מראש + B27 + אינסולין. מכות ספונטניות יש לצפות סביב בימים אלה.
    11. טיהור CM: ביום 13 ויום 16, להתחיל רעב גלוקוז על ידי שאיפת המדיום מכל באר, לשטוף כל באר עם 1 מ"ל של 1x DPBS, ולאחר מכן הוספת 5 מ"ל של RPMI מראש מינוס גלוקוז + B27 + אינסולין, בתוספת 4 מ"מ נתרן לקטט.
    12. ביום 19, לשאוף את המדיום בילה ולהחליף אותו עם 5 מ"ל של RPMI מראש + B27 + אינסולין לכל באר כדי לאפשר התאוששות התא לאחר טיהור.
    13. ביום 21, פלט מחדש תאים, בהתאם לפרוטוקול ניתוק CM המתואר להלן (שלב 3.3). המטרה צלחת 1.5-2 x 106 תאים לבאר בצלחת 6-well. לדוגמה, אם זה בידול יעיל מאוד, בדרך כלל הרחבת 6 בארות לתוך 9 בארות הוא טוב.
    14. מהיום ה-21 ומעלה, שאפו את המדיום מכל באר והחליפו אותו ב-4 מ"ל של RPMI + B27 + אינסולין כל 2-3 ימים.
      הערה: hiPSC-CMs מוכנים לשימוש ניסיוני לאחר יום 23.

3. יצירת רקמת לב תלת מימדית בתוך המכשיר המיקרופלואידי: (משך משוער: 2-3 שעות)

  1. תרבות hCF
    1. תרבות פיברובלסטים לב חדריים אנושיים (hCFs; הושג מסחרית מלונזה) בבקבוקי T75 (ב 250K תאים לבקבוק) ב פיברובלסט צמיחה מדיה-3 (FGM3). לשנות את התקשורת כל יומיים, ומעבר כאשר ב 70% מפגש. השתמש hCFs לפני המעבר 10, כפי שהם עשויים להתחיל להבדיל myofibroblasts במעברים גבוהים29.
  2. hניתוק HCF
    1. כדי לנתק את hCFs, ראשית להוציא את הבקבוק מן החממה. שים את הבקבוק בתוך ארון biosafety ולהתחיל לשאוף את התקשורת בילה מן הבקבוק. לאחר מכן, לשטוף את הבקבוק T75 עם 3 מ"ל של 1x DPBS. סגור את הכובע וסובב את הבקבוקון.
    2. לשאוף את DPBS. יש ליטול 3 מ"ל של טריפסין-EDTA 1x לפני המלחמה (0.05%) ולהוסיף אותו לבקבוקון. להטות את הבקבוק מערבולת כדי לצפות את החלק התחתון. השאירו אותו באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 דקות, ובדקו את הבקבוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מנתק, כפי שמעידים צורת התא העגול והתאים הצפים. אם לא, החזירו את הבקבוק לאינקובטור לדקה נוספת.
    3. לנטרל את פעולת טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של FGM3 מראש לבקבוק. לאחר מכן, פיפטה הפתרון למעלה ולמטה נגד החלק התחתון של הבקבוק כדי לעקור את CFs.
    4. לאסוף את המתלה התא בצינור microcentrifuge 15 מ"ל. קח 10 μL של השעיית התא ולחלק אותו hemocytometer לספור את התאים עם מיקרוסקופ.
    5. צנטריפוגה השעיית התא ב 200 x g במשך 4 דקות. לשאוף את supernatant נזהר לא להפריע גלולת התא.
    6. Resuspend גלולה טרי FGM3, כדי להפוך רצוי 75 x 106 תאים / מ"ל. או לעבור חלק (250K תאים לכל בקבוק T75) או בצע את הפרוטוקול הבא כדי ליצור רקמת לב 3D.
  3. ניתוק CM
    הערה: לאחר בידול וטיהור, הכינו את ה- CMs לשימוש בהזרקה למכשירים מיקרופלואידיים.
    1. הוציאו את צלחת ה-CMs מהחממה ושאבו את התקשורת. ואז לשטוף את הבארות עם 1 מ"ל של 1x DPBS לכל באר של צלחת 6-well. קח 6 מ"ל של DPBS ופיפט 1 מ"ל לבאר.
    2. לשאוף DPBS נזהר לא להפריע לתאים המחוברים לצלחת. פיפטה 6 מ"ל של פתרון ניתוק תאים חם (למשל, טריפל אקספרס) ולהוסיף 1 מ"ל לבאר. דגירה התאים באינקובטור 37 °C (37 °F) במשך 10 דקות.
    3. לנטרל את האנזים עם נפח שווה של RPMI + B27 + אינסולין (כלומר, 1 מ"ל לבאר) ולנתק מכנית את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה נגד כלי התרבות עם פיפטה 1 מ"ל.
    4. לאסוף את CMs בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות.
    5. לשאוף את העל-טבעי. Resuspend גלולת התא ב 5 מ"ל של RPMI + B27 + אינסולין. פיפטה הפתרון למעלה ולמטה עם פיפטה 1 מ"ל כדי להבטיח ערבוב נכון. קח 10 μL של השעיית התא ולחלק אותו hemocytometer כדי לקבוע את מספר התא הכולל.
    6. צנטריפוגה התאים שוב ב 300 x g במשך 3 דקות (כדי להבטיח הסרה מלאה של טריפל), ולשאוף את supernatant. לאחר מכן, להוסיף נפח מתאים של RPMI + B27 + אינסולין כדי להשיג 75 x 106 תאים / מ"ל.
      הערה: אם התמיינות לבבית/בחירה אינה גורמת ל- CM% גבוה (כלומר, >80%), כפי שמעידים באמצעות חיסונים או ציטומטריית זרימה לחלבונים ספציפיים ל- CM כמו cTnT, אל תתייחס לתאים כמתאימים להיווצרות הרקמה. תהליך הבידול צריך להיות אופטימיזציה כאשר זה קורה באמצעות התאמה של ריכוזי CHIR99021 וצפיפות ההתחלה הראשונית. אם טיהור CM זקוק לשיפור, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון מיון עבור CMs עם מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) או מיון תאים המופעלים באמצעות מגנטי (MACS)30,31,32.
  4. הכנת קולגן
    הערה: הכינו קולגן מהריכוז הגבוה של מלאי הקולגן (החל מ-8-11 מ"ג/מ"ל). הקולגן המשמש ליצירת התא:תערובת הידרוג'ל הוא ב 6 מ"ג / מ"ל, ואת הריכוז הסופי הוא 2 מ"ג / מ"ל. בהתאם למספר המכשירים להזרקה, יש לחשב שוב את נפח פתרון הקולגן שיש לבצע.
    1. שמור את כל ריאגנטים הנדרשים על קרח בתוך מכסה המנוע biosafety.
      הערה: קולגן הוא הידרוג'ל תרמורסונלי. לכן, הטמפרטורה צריכה להישאר נמוכה כדי למנוע פולמור מוקדם.
    2. קח 75 μL של קולגן מלאי (8 מ"ג / מ"ל) ולחלק אותו בצינור microcentrifuge על קרח. פתרון קולגן הוא צמיג מאוד, כל כך לאט לשאוף אותו עם פיפטה.
    3. קח 13.85 μL של מדיה (כלומר, RPMI + B27 + אינסולין) ולחלק אותו באותו צינור.
    4. לאחר מכן לקחת 10 μL של פנול אדום ולהוסיף את התערובת ואת resuspend.
    5. לבסוף, לקחת 1.15 μL של 1N NaOH ולהוסיף את ההשעיה.
    6. באמצעות קצה פיפטה 200 μL, resuspend ההשעיה.
      הערה: קולגן מלאי יש pH חומצי, המחייב את התוספת של NaOH כדי לנטרל לפני השימוש בו כדי לתמצת את תאי הלב. אדום פנול פועל כמחוון pH; לכן, להוסיף את זה לפני תוספת NaOH. בשלב זה, פתרון הקולגן יהיה צהוב, המציין את החומציות שלו. לאחר התוספת של NaOH, הפתרון צריך להפוך כתום ורוד בהיר, המציין את הנטרול שלה.
  5. תערובת הידרוג'ל והכנת תאים
    הערה: בשלב זה, אנקפסולציה של התאים בתוך הידרוג'ל מבוסס קולגן נעשה. התאים, כמו גם כל מבשרי הידרוג'ל, צריך להיות ממוקם על קרח במהלך השלבים הבאים.
    1. בשלב זה, אם CFs עדיין לא ניסה, לאחסן את ההשעיה CM בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל, עם המכסה לא מודבק כדי לאפשר זרימת גז, בתוך חממה 37 מעלות צלזיוס. במקביל, לנתק את CFs ולאסוף בצפיפות של 75 x 106 תאים / מ"ל עבור טעינת המכשיר.
    2. מערבבים את ה- CMs המושעים עם CFs ביחס של 4:1. קח aliquot של 8 μL של CMs ולהוסיף צינור צנטריפוגה טרי על קרח. ואז לקחת 2 μL של CFs ולהוסיף את ההשעיה התא בצינור צנטריפוגה.
    3. resuspend השעיית התא, לתפוס 5.6 μL של השעיית התא, ולשים אותו בצינור microcentrifuge טרי.
    4. קח 4 μL של קולגן רק מוכן בשלבים לעיל ולהוסיף 4:1 CM:CF תערובת. הוסף 2.4 μL של גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת קרום מרתף, מה שהופך את צפיפות התא הסופי כמו 35 x 106 תאים / מ"ל עבור הזרקת המכשיר. פיפטה התערובת למעלה ולמטה כדי להבטיח כי השעיית התא הוא הומוגני.
  6. הכנסת התקן
    הערה: לאחר התא:תערובת הידרוג'ל מוכן, זה צריך להיות מוכנס לתוך המכשירים.
    1. קח התקנים מיקרופלואידיים autoclaved מתוך תנור 80 °C (60 °F) ולהגדיר אותם בארון Biosafety לפחות 1 שעה לפני החדרת ההשעיה התא כדי לאפשר למכשירים להתקרר לטמפרטורת החדר תוך שמירה על עקרות.
    2. מניחים את המכשירים ב 60 x 15 מ"מ פטרי מנות, ב 3-4 מכשירים למנה. מלאו צלחת פטרי 150 x 15 מ"מ בשכבה דקה DI H2O כדי להכיל 3 מתוך 60 x 15 מ"מ פטרי מנות. שלב זה יוצר סביבה לחה המקיפה את המכשירים המיקרופלואידיים.
    3. השתמש טיפ חדש resuspend התא:תערובת הידרוג'ל ביסודיות על ידי pipetting ההשעיה בעוד הצינור נשאר על הקרח.
    4. הכנס את הקצה ליציאת ההזרקה של המכשיר והזרק לאט ובהתמדה 3 μL של התא: השעיית הידרוג'ל לתוך מפרצון אזור הרקמה של מכשיר מיקרופלואידי באמצעות קצה פיפטה 20 μL. לאחר מילוי היציאה, לעצור את ההזרקה ולהסיר את הקצה. חזור על הפעולה עבור כל המכשירים, או על כל המתלה ההידרוגל המוכן.
      הערה: הנפח הקטן של התא: המתלה הידרוג'ל מתחמם / מתקרר מהר מאוד, ולכן זה רלוונטי כדי לשמור על ההשעיה על הקרח במשך זמן רב ככל האפשר. בעת החדרה, פיפטה את הפתרון את הקרח ולהכניס למכשירים מהר ככל האפשר, כמו הידרוג'ל עשוי להתחיל polymerize בקצה פיפטה. חשוב ליצור כמויות קטנות של התא: המתלה הידרוג'ל בכל פעם, כך שאם מכשירים רבים יש להזריק, התא:המתלה הידרוג'ל יצטרך להיעשות טרי עבור כל קבוצה של 4 התקנים.
    5. הופכים את המכשירים בתוך צלחות הפטרי שלהם בפינצטה ומניחים אותם בתוך צלחת הפטרי הגדולה במים. דגירה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 9 דקות לפולימור הידרוג'ל.
    6. מוציאים את המכשירים מהחממה, הופכים את המכשירים זקוף, ומדגרים ב-37°C למשך 9 דקות להשלמת פולמור הידרוג'ל.
    7. הזרק RPMI + B27 + אינסולין לתוך ערוצי מדיה איגוף (~ 20 μL לכל מכשיר). מניחים את המכשירים בחזרה באינקובטור ב 37 °C (69 °F). לשנות את המדיה בתוך ערוצי התקשורת עם RPMI טרי + B27 + אינסולין כל יום. המכשירים הוכחו להיות מתורבת מ 14-21 ימים20.
      הערה: בשל נפח קטן של מדיה לכל שבב, כדי למנוע אידוי של מדיה, חשוב לשמור על המכשירים בתוך צלחת פטרי גדולה מלאה DI H2O, אשר משמש תא לח. בנוסף, טיפות קטנות של עודף RPMI + B27 + אינסולין ניתן pipetted על החלק העליון של כניסת הערוץ / שקעים במהלך שינויים שגרתיים במדיה.

4. ניתוח רקמות

  1. הדמיה חיה
    הערה: כל הדמיה חיה צריכה להתבצע עם חממת במה כדי לשמור על 37 °C (77 °F) ו 5% CO2.
    1. מקם מכשירים באינקובטור במה הנשלט על ידי הסביבה. הקלט 30 סרטונים של נקודות מרובות בתוך כל מכשיר בקצב הפריימים המקסימלי.
    2. כדי להעריך את התכווצות הרקמות לאחר חילוץ אותות המכות, השתמש בקוד MATLAB המשלים שנכתב בהתאמה אישית כדי לחלץ פסגות (קובץ משלים 2) לחישוב שונות מרווח בין פעימות.
    3. לשנות את המדיה במכשירים במכסה המנוע של תרבות התא, ואז למקם בחזרה באינקובטור תרבות התא.
  2. כתמים אימונופלואורסצנטיים
    1. הכינו PBS-גליצין: ממיסים גליצין 100 מ"מ ב-PBS ומוסיפים 0.02% NaN3 לאחסון לטווח ארוך. כוונן את ה-pH ל-7.4.
    2. הכן PBS-Tween-20: הוסף 0.05% Tween-20 ל- PBS והוסף 0.02% NaN3 לאחסון לטווח ארוך. כוונן את ה-pH ל-7.4.
    3. הכן מאגר IF: הוסף 0.2% Triton X-100, 0.1% BSA ו- 0.05% Tween-20 ל- PBS והוסף 0.02% NaN3 לאחסון לטווח ארוך. כוונן את ה-pH ל-7.4.
    4. מכינים 10% סרום עזים: משענים מחדש את סרום העזים הדו-פילי ב-2 מ"ל של PBS כדי ליצור סרום עזים 100%. לאחר מכן, לדלל את 2 מ"ל עם 18 מ"ל של PBS לעשות 10% סרום עזים.
    5. לתקן את הדגימות על ידי הוספת 4% paraformaldehyde (PFA) לערוצי הרקמה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
    6. לשטוף את התאים על ידי הוספת PBS-גליצין לתעלות הרקמה 2x במשך 10 דקות דגירה בטמפרטורת החדר.
    7. לשטוף את התאים על ידי הוספת PBS - Tween-20 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. לחלחל לתאים על ידי הוספת מאגר IF לערוצי הרקמה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. לחסום את התאים על ידי הוספת 10% פתרון סרום עזים לערוצי הרקמה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    10. לדלל את הנוגדנים העיקריים שאינם מצומדים בסרום עזים של 10% בריכוזים הרצויים (עיין בקובץ משלים 3), להוסיף לערוצי הרקמה, ולהדגיר את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
    11. למחרת, לשטוף את הדגימות על ידי הוספת PBS-Tween-20 לערוצי רקמות 3x במשך 20 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
      הערה: משלב 4.2.12 מופעל, בצע את כל המשימות בחושך, כך שהדגימות מוגנות מפני אור.
    12. לדלל את הנוגדנים המשניים PBS-Tween-20 בריכוזים הרצויים, צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 10 דקות כדי לאסוף את כל המשקעים, ולאחר מכן להוסיף לערוצי הרקמה.
    13. לאחר 30 דקות-1 שעות, לשטוף את הדגימות עם PBS-Tween-20 3x במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
    14. הוסיפו מדיום הרכבה נגד עמעום או רצוי לערוצי הרקמה. לאחר מכן, ניתן לדמיין את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או עם מיקרוסקופ קונפוקלי, אם רצוי הגדלה גבוהה יותר. כדי להמחיש את כל הרקמה התלת-ממדית, ניתן לערום ולבנות מחדש תמונות במישורי z שונים כדי ליצור תמונות תלת-ממד מייצגות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להשיג אוכלוסייה מטוהרת מאוד של CMs מ- hiPSCs, נעשה שימוש בגירסה מותאמת הכוללת שילוב של פרוטוקול הבידול של ליאן33 ושלבי הטיהור של טוהיאמה34 (עיין באיור 1A עבור ציר זמן ניסיוני). HiPSCs צריך להיות כמו מושבה, ~ 85% confluent, להתפשט באופן שווה ברחבי התרבות היטב 3-4 ימים לאחר המעבר, בתחילת הבידול CM (איור 1B). באופן ספציפי, ביום 0, מושבות hiPSC צריך להיות ביטוי גבוה של גורמי שעתוק pluripotency, כולל SOX2 ו Nanog (איור 1C). על פי פרוטוקול זה, עדות לתהליך מוצלח של בידול תאי גזע וטיהור מודגמת באיור 1D, עם מושבות צפופות של CMs המבטאות α-אקטין סרקומרי, עם מינימום סביב שאינם CMs. בנוסף, מסמכי hCFs חייבים לשמור על מורפולוגיה פיברובלסטית עם ביטוי vimentin גבוה (איור 1E), ולכן הם ישמשו לפני P10 כפי שהם עשויים להתחיל להבדיל myofibroblasts בקטעים גבוהים יותר29.

כדי לשמור על האופי החזק של פרוטוקול זה, זה רלוונטי ליישם replating של hiPSC-CMs לאחר טיהור מטבולי. בשל נוכחותם של תאים מתים ופסולת המתרחשים מרעב גלוקוז, CMs צריך צעד טיהור נוסף כדי למקסם את טוהר CM ובריאות לפני השימוש בניסוי; לכן, replating משמש כפי שהוא עוזר לשחרר את הפסולת / מת שאינם CMs(איורים 2A-B, קטעי וידאו 1-2). וידאו 1 מציג אוכלוסייה לדוגמה של CMs לפני replating, מציג עם טוהר גבוה של CMs בשכבות מרובות, אולם עם הרבה פסולת נוכח על התאים צף בתקשורת בשל הטיהור מיושם. בהתאמה, וידאו 2 מראה את אותה אוכלוסייה של CMs מיד לאחר replating, הצגת CMs ב monolayer עם באופן משמעותי פחות פסולת, המדגים את ההשפעות של עיכול רקמות ניתוק תא יחיד המתרחשים במהלך replating.

עם החדרת ההידרוגל המוטבע בתא למכשיר המיקרופלואידי (כלומר, שבב; תמונת כניסה באיור 3),התאים צפופים ומרווחים באופן שווה בין העמודים. התאים מתחילים להתפשט ביום הראשון (איור 3A), ואז ביום השביעי הם חוזרים להכות והופכים לסנכרוניים יותר בדפוסי ההתכווצות שלהם (איור 3B). בנוסף, רקמות 3D להתעבות סביב ההודעות כדי ליצור נקבוביות אליפטיות חוזרות, ואת התאים להאריך. עד היום ה-14, הרקמות שהבשילו מציגות רמה גבוהה של אניזוטרופיה (כלומר, ארגון כיווני), המורכבת מתאים בעלי צורה מוארכת (איורים 3C, 4A), סרקומרים מפוסלים, מיושרים וצמתים מקומיים של פערים(איור 4B). יתר על כן, דפוסי ההתכווצות הספונטניים של רקמות אלה הם סינכרוניים מאוד (איור 4C, וידאו 3) בשל האופי המחובר, המיושר של תאי הלב.

Figure 1
איור 1: תמונות סכמטיות וייציגיות ניסיוניות של מורפולוגיה תאית במהלך ההכנה להזרקת מכשיר: סכמטי של הפרוטוקול, המתאר צעדים לאחר ייצור מכשירים מיקרופלואידיים, מתרבות hiPSC ועד להיווצרות רקמת לב מיקרופלואידית (A). hiPSCs צריך לשמור על מורפולוגיה דמוית מושבה (B) וביטוי גבוה של סמני פלוריפוטנציה (SOX2, ירוק; ננוג, אדום) (C) על תחילתה של בידול. לאחר בידול hiPSC-CM, צריך להיות בשפע, כתמים צפופים של CMs, כמו מוכתם עם אלפא-אקטין סרקומרי (SAA, ירוק), עם מינימום שמסביב שאינם CMs, כפי שמעידים כתמי vimentin (vim, אדום) (D). hCFs צריך להציג עם רמות גבוהות של ביטוי vimentin ולשמור על מורפולוגיה פיברובלסט (E). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אוכלוסיות hiPSC-CM בשלבים האחרונים של הבידול: תהליך הטיהור גורם למותם של מי שאינם CMs, ומייצר פסולת בתרבות התאים, הנמצאת לפני התזה מחדש של CM (A). לאחר replating(B),הפסולת ולא CMs הם נעק, המשרתים כדי לטהר עוד יותר את האוכלוסייה CM. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: היווצרות רקמת תלת-ממד לבבית אנושית בתוך המכשיר המיקרופלואידי: ביום שלאחר ההזרקה למכשיר (המוצגת בזרם השמאלי העליון, ליד אגורה אמריקאית לקנה מידה), התאים יתחילו להתפשט ויהיו צפופים ומופצים באופן הומוגני ברחבי המכשיר (A). לאחר שבוע של תרבות, התאים יחזרו להכות באופן ספונטני וליצור רקמות מרוכזות ומיושרות (B). על ידי שבועיים של תרבות, התאים יוצרים מרוכז, רקמות מיושרות סביב ההודעות האליפטיות (C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מאפיינים מייצגים של רקמת לב אנושית לאחר תרבות במשך 14 יום במכשיר המיקרופלואידי: התאים יצרו רקמות מוארכות, מיושרות מאוד, כפי שמציין על ידי כתמי actin (A). הסרקומרים מקבילים ומנוקבים, ויש לוקליזציה של צמתים פער כפי שמעידים צביעה על α-actinic סרקומרי (SAA) ו connexin 43 (CX43), בהתאמה (B). ההתכווצות הספונטנית היא סינכרונית (C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: התכווצות ספונטנית של hiPSC-CMs ביום 21 לאחר טיהור לקטט ולפני replating אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 2: התכווצות ספונטנית של hiPSC-CMs ביום 23 לאחר replating אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 3: סינכרוני, התכווצות ספונטנית של רקמת לב אנושית בתוך המכשיר במשך 14 ימים אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

קובץ משלים 1: קובץ AutoCAD עבור התקן לב על שבב אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: תוכנית MATLAB כדי לחלץ פסגות כדי לקבוע את השונות מרווח בין פעימות מאותות מכות אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: טבלה של נוגדנים ראשוניים ומשניים אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היווצרות מודל רקמת לב אנושי במבחנה עם אינטראקציות משופרות בין תאי התא ומבנה 3D ביומימטי הוא הכרחי למחקר לב וכלי דם בסיסי ויישומים קליניים מתאימים1. פרוטוקול מתואר זה מסביר את הפיתוח של רקמת לב אניזוטרופית אנושית תלת מימדית בתוך מכשיר מיקרופלואידי, תוך שימוש בתרבות משותפת של CMs שמקורם בתאי גזע עם CFs חיבור עטוף בתוך הידרוג'ל קולגן, המשמש לדגמן את הרכב התא המורכב ואת המבנה של שריר הלב המקומי. פרוטוקול ספציפי זה הוא לשחזור מאוד, כמו המבנה המסוים של המכשיר כבר אופטימיזציה ואימות עבור היווצרות רקמת לב 3D anisotropic משני תאי לב שמקורם בחולדה, ואת תאי גזע אנושיים מובחנים CMs, מ hESCs, ושני סוגים של hiPSCs (SCVI20 ו IMR90-4) כפי שהוכח בפרסום האחרון שלנו20. אנו, בין קבוצות רבות אחרות, מצאנו כי היעילות של CM-בידול של תאי גזע משתנה בין קווי התא35,36. פרוטוקול הטיהור המיושם מסייע בהגדלת תשואת הבידול; עם זאת, משך זמן הטיהור תלוי בקו התא וביעילות הבידול. לכן, ההצלחה הנובעת מהיווצרות הרקמות המיקרופלואידיות עשויה להשתנות בין קווי התא.

כדי ללכוד רכיבים רלוונטיים של שריר הלב, ההרכב התאי עבור הרקמות שהפגינו הוא בעיקר תערובת של CMs ו- CFs, כמו CMs לסכן את רוב הנפח בעוד CFs לשמור על רוב אוכלוסיית התא בתוך הלב37. יתר על כן, היחס המסוים של 4:1 CM:CFs אומת בהרחבה בעבודה שפורסמה לאחרונה20 כדי לגרום מבנה אופטימלי היווצרות רקמת לב בתוך פלטפורמה זו. מחקרים עתידיים מעורבים פלטפורמה זו המתוארת יכול להיות מתקדם יותר במורכבות שלהם על ידי תוספי עם סוגי תאים חוזרים בתשובה אחרים כדי לחקות טוב יותר את שריר הלב המקורי. לדוגמה, לאחרונה נמצא כי מקרופאגים תושב הם חלק בלתי נפרד בתהליכי הולכה בתוך הלב38, בנוסף לתפקידם המתועד היטב בתגובה החיסונית39. לכן, מקרופאגים יכולים להיות משולבים בתערובת התאים לפני אנקפסולציה הידרוג'ל לדגם מקרופאגים לב תושב. לחלופין, מונוציטים יכולים להיות מועברים דרך ערוצי התקשורת כמודל של גיוס דרך זרימת הדם, אשר עלול להוביל לאוכלוסייה של מקרופאגים דלקתיים בתוך רקמת הלב.

ישנם יתרונות מובנים בשימוש במכשיר microfluidic כפלטפורמה לבניית מודלים רקמות 3D. במיוחד, ניסויים מבוססי דיפוזיה מדויקת ניתן להקים באמצעות שליטה מדויקת של כימיקלים, מולקולות, או גזים המאפשרים שיפוע ריכוז על פני מכשיר18,20. בנוסף, קבוצות מגוונות של סוגי תאים40 וזרימת נוזלים ניתן לשלב כדי לחקות תנאי תרבות דינמיים ולספק מתח גזירה על תאים זרע41. זה האחרון עשוי להיות שימוש מיוחד במחקר של מערכת כלי דם משולבת בתוך השבב, כמו תאים אנדותל ניתן לזרוע בערוצי התקשורת הסמוכים (כפי שהוכחנו בעבר באמצעות מכשיר זה כדי מודל אסטרוציטים על שבב23), זרימת נוזל קבוע לחקות נימים ניתן לשלב בקלות באמצעות משאבה מבוססת ואקום או מבוסס כבידה.

יתרון נוסף של המכשיר המיקרופלואידי הוא החומר (כלומר, PDMS) המשמש לייצור ערוצי המכשיר. באופן ספציפי, PDMS הוא פולימר שקוף, זול וביו-תואם42 עם נוקשות הניתנת להתאמה בקלות. הצעד המגביל בייצור של מכשירים אלה טמון בפוטוליתוגרפיה, שכן הטכניקה דורשת גישה לחדר נקי ורכישת המיומנות הנלווית. עם זאת, ברגע הוופל הוא מפוברק, זה יכול לשמש כדי להפוך מאות מכשירים באמצעות תהליך ליטוגרפיה רכה ישר קדימה כדי ליצור את ערוצי PDMS ואת הפעולה הפשוטה של מליטה פלזמה כדי לאטום את הערוצים כדי coverslips. במחקרים עתידיים, אם המכשיר היה להיות שונה לכלול את היכולת למדוד תכונות חשמליות של הרקמה בזמן אמת, צעד נוסף של התאמת המכשיר עם אלקטרודות ורכיבים מוליך היה צריך להיות משולב בתהליך הייצור. השימוש ב- PDMS כדי לפברק את הערוץ עשוי לשמור על מגבלות, במיוחד אם נעשה שימוש במבנים למחקרי תגובה לסמים, שכן PDMS נמצאה לספח מולקולות הידרופוביות קטנות43,44,45. לכן, חומרים אחרים, כגון תרמופלסטיקה46,47, יכול להיחקר כחלופות PDMS במהלך תהליך ליתוגרפיה רכה.

שלב קריטי בפרוטוקול המתואר הזה הוא שלב 3.6.4 המפרט תא: החדרת הידרוג'ל למכשירים המיקרופלואידיים. יש לשלוט בכמה משתנים מרכזיים כדי להבטיח הצלחה, כולל טמפרטורה, זמן וטיפול נכון. אם פתרונות מלאי ההידרוגל או תמיסת ההידרוגל המוכנה מגיעים לטמפרטורת החדר, הם נמצאים בסיכון לפולימריזציה חלקית, שהיא בלתי הפיכה, מה שהופך את הפתרון צמיג וכמעט בלתי אפשרי להזריק למכשיר ללא דליפה לערוצי מדיה. מצד שני, התא:פתרון הידרוג'ל לא יכול לקפוא, כמו התאים ימותו; לכן הפתרון חייב להישמר בתוך חלון טמפרטורה צר זה. באופן דומה, משך הזמן שחלף בין התא: הכנת הידרוג'ל והזרקת מכשיר מתייחסת ישירות להגברת הטמפרטורה של הפתרון המוכן. באופן ספציפי, ברגע שהפתרון נעשה ואת aliquot (כלומר, 3 μL) מתקבל, פיפטה מחזיק את aliquot יש למקם מחדש, כך הקצה הוא בתוך יציאות המכשיר, ואת aliquot הוא להיות מוכנס לאט ובהתמדה לתוך המכשיר. לאורך כל המעבר הזה, הנפח הקטן נמצא בתוך קצה פיפטה שנמצא בטמפרטורת החדר, ולכן, הפתרון מגביר במהירות את הטמפרטורה מזה של הקרח עליו הוא הוכן (כלומר, -20 מעלות צלזיוס), הדורש תהליך הזרקה מהיר למדי. אם רגישות הטמפרטורה של הידרוג'ל מבוסס קולגן הופך לגורם מפתח במהלך הזרקת המכשיר, שילוב של הידרוג'לים אחרים48, כגון הידרוג'לים פוטוקרוסלינקיים (כלומר, GelMA)47,49,50,51 או הידרוג'לים מקושרים אנזימטית (כלומר, פיברין)11,52,53, ניתן לחקור.

העיצוב של המכשיר המיקרופלואידי הכלול בפרוטוקול זה מאפשר הקמת רקמה אניזוטרופית בשל נוכחותם של ההודעות האליפטיות המדשדשות, הבולטות בתוך ערוץ הרקמה הראשי20. תכונה זו היא יתרון על פני שיטות אחרות, כגון הדפסת מגע ECM, כי זה לא דורש שלב טיפול כדי ליצור את הטופוגרפיה שעלולה להוביל וריאציה בין דגימות עקב עיוות בולים או דיו54. עם זאת, כאמור קודם לכן, לעתים קרובות יש קשיים הטבועים בהזרקת תא: השעיית הידרוג'ל לערוץ מכשיר, במיוחד בערוץ עם פוסטים מולדים. למטרה זו, הלחץ הטיפולי של החדרת מכשיר הוא רגיש למדי. תהליך ההזרקה צריך להיות יציב, בלחץ עקבי ונמוך יחסית כדי למנוע דליפה לערוצי התקשורת.

בנוסף, בועות לא ניתן להציג גם במהלך הכנת הפתרון או במהלך החדרת המכשיר, כמו בועות יגרום דליפה מערוץ הרקמה הראשי לתוך ערוצי התקשורת. לכן, טיפול נאות נדרש כדי לשלוט בטיפול, טמפרטורה, ותזמון של התא:הזרקת הידרוג'ל כדי להבטיח את ההצלחה בהיווצרות של רקמה מבוזרת הומוגנית 3D. לכן, תרגול בטיפול במכשירים microfluidic לפני ניסויים תרבות התא עשוי להיות מועיל. תחזוקה לאחר מכן של רקמות בתוך מכשירים microfluidic הוא די פשוט, פשוט מחייב שינוי מדיה יומי של נפח 20 μL, ואת coverslip הבסיס של המכשיר הופך טיפול נוח במהלך הדמיה בזמן אמת.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר בזאת משתמש בשילוב של טכניקות מיקרומולדינג, כולל פוטוליטוגרפיה וליטוגרפיה רכה, כדי ליצור ארכיטקטורה מורכבת בתוך מכשיר מיקרופלואידי שגורם לרמות גבוהות של אניזוטרופיה של רקמת תלת מימד, עם טכניקות ביולוגיות חזקות, כולל בידול תאי גזע, תרבות תאים אנושית ראשונית וביו-חומרים מבוססי הידרוג'ל. התוצאה הסופית של הפרוטוקול המתואר היא רקמת לב מתואמת, תלת-ממדית בתרבית משותפת בתוך שבב מיקרופלואידי עם פנוטיפ בוגר, שנומת שוב ושוב עבור סוגי תאים וקווים שונים מרובים20, מה שמביע אותו מתאים למידול מחלות ויישומים פרה-קוליניים במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות #1653193 פרס NSF CAREER, פרס ועדת המחקר הביו-רפואי של אריזונה (ABRC) (ADHS18-198872), ופרס קרן פלין על מתן מקורות מימון לפרויקט זה. קו HIPSC, SCVI20, התקבל מג'וזף סי וו, MD, דוקטורט במכון הלב וכלי הדם של סטנפורד במימון NIH R24 HL117756. קו hiPSC, IMR90-4, התקבל ממכון המחקר WiCell55,56.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.65 mL centrifuge tubes VWR 87003-290
1 mm Biopsy punch VWR 95039-090
1.5 mm Biopsy punch VWR 95039-088
15 mL Falcon tubes VWR 89039-670
18x18mm coverslips VWR 16004-308 The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehyde ThermoFisher 101176-014
6-well flat botttom tissue-culture plates VWR 82050-844
B27 minus insulin LifeTech A1895602
B27 plus insulin LifeTech 17504001
CHIR99021 VWR 10188-030
Collagen I, rat tail Corning 47747-218
DMEM F12 ThermoFisher 11330057
DPBS ThermoFisher 21600069
E8 ThermoFisher A1517001 can also be made in house
EDTA VWR 45001-122
Ethanol
FGM3 VWR 10172-048
GFR-Matrigel VWR 47743-718
Glycine Sigma G8898-500G
Goat serum VWR 10152-212
hESC-Matrigel Corning BD354277
IPA
IWP2 Sigma I0536-5MG
Kimwipes VWR 82003-820
MTCS Sigma 440299-1L
NaN3 Sigma S2002-25G
NaOH Sigma S5881-500G
Pen/Strep VWR 15140122
Petri dish (150x15mm) VWR 25384-326
Petri dish (60x15mm) VWR 25384-092
Phenol Red Sigma P3532-5G
RPMI 1640 ThermoFisher MT10040CM
RPMI 1640 minus glucose VWR 45001-110
Silicon Wafers (100mm) University Wafer 1196
Sodium lactate Sigma L4263-100ML
SU8 2075 Microchem Y111074 0500L1GL
SU8 Developer ThermoFisher NC9901158
Sylgard Elastomer Essex Brownell DC-184-1.1
T75 flasks VWR 82050-856
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
TrypLE ThermoFisher 12604021
Trypsin-EDTA (0.5%) ThermoFisher 15400054
Tween20 Sigma P9416-50ML
Y-27632 Stem Cell Technologies 72304
EVG620 Aligner EVG
Plasma cleaner PDC-32G Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscope Nikon
Leica SP8 Confocal microscope Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147 (2012).
  5. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033 (2020).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118, 400-409 (2016).
  7. LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, Springer. Parts of the Developments in Cardiovascular Medicine book series 3-21 (2005).
  8. Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29 (2019).
  9. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  10. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397 (2011).
  11. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  12. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
  13. Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
  14. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
  16. Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
  17. Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105 (2017).
  18. Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883 (2015).
  19. Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741 (2020).
  20. Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195 (2020).
  21. Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 7, 3139-3151 (2019).
  22. Benam, K. H., et al. Engineered in vitro disease models. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 10, 195-262 (2015).
  23. Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810 (2020).
  24. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
  26. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
  27. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
  28. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
  29. Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809 (2020).
  30. Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
  31. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657 (2011).
  32. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
  33. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
  34. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
  35. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  36. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  37. Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
  38. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
  39. Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
  40. Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells - Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
  41. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  42. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
  43. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
  44. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
  45. Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
  46. Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
  47. Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133 (2020).
  48. Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
  49. Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
  50. Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
  51. Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
  52. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
  53. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
  54. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
  55. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  56. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 172 תאי גזע רקמת לב מיקרו-וירוס שריר הלב שבבים מיקרופלואידיים
פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veldhuizen, J., Nikkhah, M.… More

Veldhuizen, J., Nikkhah, M. Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (172), e62539, doi:10.3791/62539 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter