Summary
Målet med detta protokoll är att förklara och demonstrera utvecklingen av en tredimensionell (3D) mikrofluidisk modell av högjusterad mänsklig hjärtvävnad, bestående av stamcellsbaserade kardiomyocyter som odlas med hjärtfibroblaster (CFs) inom en biomimetisk, kollagenbaserad hydrogel, för tillämpningar inom hjärtvävnadsteknik, läkemedelsscreening och sjukdomsmodellering.
Abstract
Den främsta dödsorsaken i världen kvarstår som hjärt-kärlsjukdom (CVD). Modellering av hjärtmuskelns fysiologiska och biologiska komplexitet, hjärtmuskeln, är dock notoriskt svår att uppnå in vitro. Främst ligger hinder i behovet av mänskliga kardiomyocyter (CMs) som antingen är vuxna eller uppvisar vuxenliknande fenotyper och framgångsrikt kan replikera hjärtmuskelns cellulära komplexitet och invecklade 3D-arkitektur. Tyvärr, på grund av etiska farhågor och brist på tillgänglig primära patient-härledda mänskliga hjärtvävnad, i kombination med minimal spridning av CMs, inköp av livskraftiga mänskliga CMs har varit ett begränsande steg för hjärtvävnadsteknik. För detta ändamål har den mesta forskningen övergick till hjärt differentiering av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) som den primära källan till mänskliga CMs, vilket resulterar i ett brett införlivande av hiPSC-CMs inom in vitro-analyser för hjärtvävnadsmodellering.
Här i detta arbete visar vi ett protokoll för att utveckla en 3D mogen stamcells-härledd mänsklig hjärtvävnad inom en mikrofluidisk enhet. Vi förklarar specifikt och visuellt visar produktionen av en 3D in vitro anisotropic hjärt vävnad-på-ett-chip modell från hiPSC-härledda CMs. Vi beskriver främst ett rening protokoll att välja för CMs, samkulturen av celler med ett definierat förhållande via blandning av CMs med mänskliga CFs (hCFs) och suspension av denna samkultur inom kollagen-baserade hydrogel. Vi visar vidare injektionen av cell-lastade hydrogel inom vår väldefinierade mikrofluidic enhet, inbäddad med förskjutna elliptiska mikroposter som tjänar som ytan topografi för att inducera en hög grad av inriktning av de omgivande cellerna och hydrogel matrisen, härma arkitekturen i den inhemska myokardiet. Vi föreställer oss att den föreslagna 3D anisotropa hjärt-vävnad-på-chip-modellen är lämplig för grundläggande biologistudier, sjukdomsmodellering och, genom dess användning som screeningverktyg, farmaceutisk testning.
Introduction
Vävnadstekniska metoder har utforskats i stor utsträckning under de senaste åren för att följa kliniska fynd in vivo i regenerativ medicin och sjukdomsmodellering1,2. Betydande tonvikt har särskilt lagts på in vitro hjärtvävnad modellering på grund av de inneboende svårigheterna att köpa mänskliga primära hjärtvävnad och producera fysiologiskt relevanta in vitro surrogater, begränsa den grundläggande förståelsen av de komplexa mekanismerna för hjärt-kärlsjukdomar (CVDs)1,3. Traditionella modeller har ofta involverat 2D monolayer kultur analyser. Vikten av att odla hjärtceller i en 3D-miljö för att efterlikna både myokardiets inhemska landskap och komplexa cellulära interaktioner har dock karakteriseratsi stor utsträckning 4,5. Dessutom har de flesta modeller som hittills producerats inkluderat en monokultur av CMs differentierade från stamceller. Hjärtat består dock av flera celltyper6 inom en komplex 3D-arkitektur7, vilket motiverar det kritiska behovet av att förbättra komplexiteten i vävnadssammansättningen inom 3D-in vitro-modeller för att bättre efterlikna cellulära beståndsdelar i det inhemska hjärtmuskeln.
Hittills har många olika tillvägagångssätt utforskats för att producera biomimetiska 3D-modeller av myokardiet8. Dessa metoder sträcker sig från experimentella inställningar som möjliggör realtidsberäkning av genererad kraft, från monokulturella CMs sådda på tunna filmer (bedöms muskulösa tunna filmer (MTFs))9, till samkulturella hjärtceller i 3D hydrogelmatriser upphängda bland fristående kantilevers (anses konstruerade hjärtvävnader (EHTs))10. Andra metoder har fokuserat på att implementera mikromolding tekniker för att efterlikna hjärtinfarkt anisotropi, från monokulturella CMs i en 3D hydrogel suspenderad bland utskjutande mikroposter i en vävnad patch11, till monokultur CMs sådd bland indragna mikrogrooves12,13. Det finns inneboende fördelar och nackdelar med var och en av dessa metoder, därför är det relevant att använda tekniken som överensstämmer med den avsedda tillämpningen och motsvarande biologiska fråga.
Förmågan att förbättra mognaden av stamcells-härledda CMs är avgörande för framgångsrik in vitro-teknik av vuxen-liknande hjärtmuskelvävnad och översättning av efterföljande resultat till kliniska tolkningar. För detta ändamål har metoder för mogna CMs utforskats i stor utsträckning, både i 2D och 3D14,15,16. Till exempel leder elektrisk stimulering som ingår i EHT, påtvingad anpassning av CMs med yttopografi, signalsignaler, tillväxtfaktorer från samkultur och / eller 3D-hydrogelförhållanden etc., alla till en förändring till förmån för CM-mognad i minst en av följande: cellmorfologi, kalciumhantering, sarkomisk struktur, genuttryck eller kontraktil kraft.
Av dessa modeller behåller metoderna som använder mikrofluidiska plattformar vissa fördelar i naturen, såsom kontroll av gradienter, begränsad cellinmatning och minimala nödvändiga reagenser. Dessutom kan många biologiska replikat genereras samtidigt med hjälp av mikrofluidiska plattformar, vilket tjänar till att bättre dissekera den biologiska mekanismen av intresse och öka den experimentella provstorleken till förmån för statistiskkraft 17,18,19. Dessutom, med hjälp av fotolitografi i den mikrofluidiska enheten tillverkningsprocessen gör det möjligt att skapa exakta funktioner (t.ex. topografier) på mikro- och nanonivå, som fungerar som mesoskopiska signaler för att förbättra den omgivande cellulära strukturen och makronivåvävnadsarkitektur 18,20,21,22 för olika tillämpningar inom vävnadsregenerering och sjukdomsmodellering.
Vi har tidigare visat utvecklingen av en ny 3D hjärt vävnad on-chip modell som innehåller ytan topografi, i form av medfödda elliptiska mikroposter, att justera hydrogel-inkapslade co-odlade hjärtceller i en sammankopplad, anisotropavävnad 20. Efter 14 dagars kultur är de vävnader som bildas inom mikrofluidiska enheten mer mogna i sin fenotyp, genuttrycksprofil, kalciumhanteringsegenskaper och farmaceutiska svar jämfört med monolayer och 3D isotropa kontroller23. Protokollet som beskrivs häri beskriver metoden för att skapa denna 3D-odlade, justerade (dvs. anisotropa) mänskliga hjärtvävnad inom den mikrofluidiska enheten med hjälp av hiPSC-härledda CMs. Specifikt förklarar vi metoderna för att differentiera och rena hiPSCs mot CMs, tillskott av hCFs med CMs att producera en etablerad samkulturpopulation, införande av cellpopulationen inkapslad i kollagenhydrgeln i mikrofluidiska enheter och efterföljande analys av 3D konstruerade vävnader genom contractile och immunofluorescent analyser. De resulterande 3D-konstruerade mikrovävnaderna är lämpliga för olika tillämpningar, inklusive grundläggande biologistudier, CVD-modellering och läkemedelstestning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utför alla cellhanterings- och reagenspreparat inom ett biosäkerhetsskåp. Se till att alla ytor, material och utrustning som kommer i kontakt med celler är sterila (dvs. spraya ner med 70% etanol). Celler ska odlas i en fuktad 37 °C, 5% CO2 inkubator. All hiPSC-kultur och differentiering utförs i 6-brunnsplattor.
1. Mikrofluidisk anordning skapande (ungefärlig varaktighet: 1 vecka)
-
Photolithography
OBS: Masken, utformad med CAD-filen (som tillhandahålls som kompletterande fil 1),innehåller utformningen av den mikrofluidiska kanalen. Skriv ut designen på en genomskinlig mask. Utför sedan standard fotolitografi med den negativa fotoresisten SU8 2075 på en 4-tums kiselskiva i ett rent rum.- Rengör en kiselskiva med isopropylalkohol (IPA) och torka med kväve. Grädda vid 200 °C i 5 min för uttorkning.
OBS: Hantera skivan med wafer pincett. - Placera skivan i spin-coater. Sätt in 3-4 ml SU8 i mitten av skivan och snurra sedan för att bilda ett lager på 200 μm (dvs. rampa upp 15 s till 500 varv/min, snurra i 10 s, rampa upp 5 s till 1 200 varv/min och snurra i 30 varv/min och sedan spinn i 15 s tills den stoppas).
- Ta bort skivan och grädda i 7 min vid 65 °C, sedan 45 min vid 95 °C.
- Flytta skivan till en maskjusterare och placera den genomskinliga masken i maskhållaren med ett UV-filter. Exponera skivan för 2 cykler på 230 mJ/cm2, med 30 s fördröjning, för en total exponering på 460 mJ/cm2.
- Utför en bakning efter exponering på den exponerade skivan i en 50 °C ugn över natten.
- Stäng av ugnen nästa morgon, och efter att skivan har svalnat till rumstemperatur, sänk ner den i SU8-utvecklare. Ta bort skivan från utvecklaren var 5: e minut och tvätta med IPA och placera den sedan tillbaka i utvecklaren.
- Efter cirka 20 minuter, eller när IPA är klar, torka skivan med luftkväve och hårdbaka i en ugn inställd på 150 °C. Så snart ugnen når 150 °C, stäng av den men öppna den inte. Lämna skivan i ugnen tills den har uppnått rumstemperatur och ta sedan bort skivan.
- Bekräfta su8-höjden med en profilometer och de optiska funktionerna med ett ljusmikroskop. När det har bekräftats tejpar du skivan inuti en petriskål i 150 mm plast.
- Rengör en kiselskiva med isopropylalkohol (IPA) och torka med kväve. Grädda vid 200 °C i 5 min för uttorkning.
-
Mjuk litografi
OBS: Skivan, tejpad på Petri-skålen, måste silaniseras för att förhindra att PDMS följs till SU8-funktionerna.- Vänd skivan (knackad på en petriskål av plast) över en petriskål i glas av samma storlek som innehåller 0,4 ml metyltriklorosilan (MTCS) och exponera skivan för ångorna i 4 minuter. Vrid skivan upprätt och lägg locket på Petri-skålen.
- Blanda 30 g silikon elastomerbas till härdningsmedlet med ett förhållande på 10:1. Ta bort locket från Petri-skålen och häll polydimethylsiloxan (PDMS) på skivan och avgasa sedan i en desiccator.
- När alla bubblor är borta, placera skivan vid 80 °C i 1,5 h för att bota PDMS.
- Skala försiktigt av PDMS och stansa inlopp och uttag för vävnadsportarna och mediekanalerna med en 1 mm respektive 1,5 mm biopsi stans.
- Rengör PDMS-kanalerna med tejp för att avlägsna damm. Blötlägg sedan täckena (18 x 18 mm, nr 1) i 70% etanol i minst 15 minuter. Torka sedan av dessa med vävnadsservetter.
- Håll både täcken och PDMS-kanaler (funktionssidan exponerad) mot plasman (inställningen på hög) i 1 min, bind sedan snabbt ihop och placera i en 80 °C ugn över natten för att säkra bindningen.
OBS: Under limning är det viktigt att applicera milt tryck på kanterna på PDMS-kanalerna för att säkerställa en bra tätning mellan PDMS och glaset samtidigt som kanalen själv undviks för att förhindra kanalkollaps.
-
Förberedelse av enheter
- Dränk de bundna PDMS-enheterna i avjoniserat vatten (DI H2O) och autoklav med vätskecykeln. Därefter aspirerar du vätskan från enheterna och autoklaverar igen med gravitationscykeln. Torka sedan ut de steriliserade enheterna över natten vid 80 °C.
2. Stamcellskultur (ungefärlig varaktighet: 1-2 månader)
- hiPSC kultur och underhåll
OBS: HiPSCs måste odlas för tre på varandra följande passager efter upptining in vitro före kryopreservation eller differentiering. hiPSCs odlas i antingen E8 eller mTeSR1 medium, beroende på cellinjen, på källaren membran matrisbelagdaplattor 24.- För att täcka plattor med hESC-kvalitet källarmembranmatris, tina en alikvot av matrismediet (partiberoende volym, i allmänhet 200-300 μL; lagrad vid -80 °C) genom att lägga till den till 25 ml DMEM / F-12K på is. Dispensera 1 ml av denna fjädring i varje brunn på en 6-brunnsplatta. Låt plattan vara i inkubatorn vid 37 °C i minst 1 timme.
- Vid upptining, modifiera E8-media för hiPSC-kultur genom att lägga till 5 μM Y-2763225 (E8 +RI). Använd det här mediet i 24 timmar efteråt och byt sedan media till färsk E8.
OBS: För rutinmässiga medieförändringar används omodifierade E8-medier för hiPSC-kultur. För regelbundet underhåll måste E8-media bytas varje dag, cirka 24 timmar efter det tidigare mediebytet. - Passageceller på dag 3 eller dag 4, aspirera media och tvätta sedan varje brunn med 1 ml 1x Dulbeccos fosfatbuffrade lösning (DPBS).
OBS: Se till att cellerna är cirka 70% konfluenta. Låt dem inte växa mer än 70% confluency. - Aspirera DPBS, tillsätt sedan 1 ml 0,5 mM EDTA till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 6-7 min.
- Aspirera försiktigt EDTA, tillsätt 1 ml E8+RI i varje brunn och bläddra mot ytan med en 1 ml pipett (~ 5-10 gånger för att samla alla celler). Samla cellfjädringen i ett 15 ml mikrocentrifugrör.
- Räkna cellfjädringen och passagen med önskad celltäthet (dvs~ 200 K per brunn) i E8 +RI.
- Byt media till E8 (utan RI) 24 h efter. Lämna inte cellerna med RI i mer än 24 timmar.
OBS: E8 får inte värmas upp till 37 °C. Lämna den alltid i rumstemperatur för uppvärmning före cellkulturen.
- Kardiomyocyt (CM) riktad differentiering
OBS: Det är viktigt att notera förekomsten av heterogenitet mellan olika linjer i hiPSCs26,27, så följande steg kan behöva optimeras för varje cellinje. Följ stegen nedan för CM-differentiering.- Bered RPMI + B27 - insulin genom att tillsätta 10 ml B27 minus insulin och 5 ml penicillin/streptomycin (penna/strep) till 500 ml RPMI 1640.
- Förbered RPMI + B27 + insulin genom att tillsätta 10 ml B27 och 5 ml penna/strep till 500 ml RPMI 1640.
- Förbered RPMI minus glukos + B27 + insulin genom att tillsätta 10 ml B27, 5 ml penna/strep och 4 mM natriumlaktat till 500 ml RPMI 1640 utan glukos.
- När hiPSCs når 85% confluency, börja differentiering (dag 0) genom att ersätta det gamla mediet med 4 ml RPMI + B27 - insulinmedium som innehåller 10 μM CHIR99021 till varje brunn på en 6-brunnsplatta (dvs. tillsätt 25 μL 10 mM CHIR99021 i 25 ml RPMI + B27 - insulin och tillsätt sedan omedelbart 4 ml per brunn).
OBS: CHIR99021 är en GSK-hämmare och leder till Wnt-aktivering. Den optimala koncentrationen av CHIR99021 och den första sammanflödet varierar för varje cellinje28. Kontrollera alltid en koncentrationsgradient på 6-12 μM CHIR99021 och en serie såddtätheter före själva experimentet för att bestämma optimala förhållanden för att initiera differentiering. - Exakt 24 timmar senare (dag 1), aspirera mediet och ersätt med 5 ml förvärmt RPMI + B27 - insulin till varje brunn.
- Exakt 72 h efter CHIR99021-tillägg (dag 3), samla 2,5 ml av det förbrukade mediet från varje brunn på 6-brunnsplattan, totalt 15 ml av det förbrukade mediet i ett rör.
- Tillsätt därför 15 ml färskt RPMI + B27 - insulinmedium. Tillsätt IWP2 till en koncentration på 5 μM till det kombinerade mellanröret (dvs. 1 μL IWP2 vid 5 mM per 1 ml kombinerat medium eller 30 μL IWP2 i 30 totalt mL-medium).
- Ta bort ~1,5 ml av plattans återstående medium per brunn så att 1 ml av mediet kvarstår. Snurra plattan kraftigt för att säkerställa att cellrester avlägsnas på lämpligt sätt. Aspirera sedan resten av det gamla mediet och tillsätt 5 ml av det kombinerade mediet som innehåller IWP2 per brunn på plattan.
OBS: Tillsats av IWP2 till cellerna leder till Wnt-hämning. - På dag 5, aspirera mediet från varje brunn och ersätt det med 5 ml förvärmt RPMI + B27 - insulin.
- CM Mognad: På dag 7, dag 9 och dag 11, aspirera mediet från varje brunn och ersätt det med 5 ml förvärmt RPMI + B27 + insulin. Spontan misshandel bör observeras runt dessa dagar.
- CM Rening: På dag 13 och dag 16, börja glukos svält genom att aspirera mediet från varje brunn, tvätta varje brunn med 1 ml 1x DPBS och sedan lägga till 5 ml förvärmd RPMI minus glukos + B27 + insulin, kompletterat med 4 mM natriumlaktat.
- På dag 19, aspirera det använda mediet och ersätt det med 5 ml förvärmt RPMI + B27 + insulin till varje brunn för att möjliggöra cellåterställning efter rening.
- På dag 21, replatera celler, enligt nedan beskrivna CM dissociation protokoll (steg 3.3). Sikta på att plätera 1,5-2 x 106 celler per brunn i en 6-brunnsplatta. Till exempel, om det är en mycket effektiv differentiering, är det generellt bra att utöka de 6 brunnarna till 9 brunnar.
- Från dag 21 och fram, aspirera mediet från varje brunn och ersätt det med 4 ml RPMI + B27 + insulin var 2-3: e dag.
HIPSC-CMs är klara för experimentell användning efter dag 23.
3. Skapande av 3D-hjärtvävnad i den mikrofluidiska enheten: (Ungefärlig varaktighet: 2-3 timmar)
- hCF kultur
- Kultur human ventrikulära hjärtfibroblaster (hCFs; erhållna kommersiellt från Lonza) i T75 flaskor (vid 250K celler per kolv) i Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Byt media varannan dag och passage när du är 70% konfluent. Använd hCFs före passage 10, eftersom de kan börja skilja sig från myofibroblaster vid höga passager29.
- hCF-dissociation
- För att ta bort hCFs, ta först ut kolven från inkubatorn. Lägg kolven i biosäkerhetsskåpet och börja aspirera på det använda mediet från kolven. Tvätta sedan T75-kolven med 3 ml 1x DPBS. Stäng locket och snurra kolven.
- Aspirera DPBS. Ta 3 ml förvärmd 1x Trypsin-EDTA (0,05%) och lägg den i kolven. Luta kolven och snurra för att täcka botten. Låt den vara i en inkubator på 37 °C i 4-6 minuter och kontrollera kolven under ett mikroskop för att säkerställa att cellerna lossar, vilket framgår av den runda cellformen och flytande celler. Om inte, lägg sedan tillbaka kolven i inkubatorn i ytterligare en minut.
- Neutralisera trypsinverkan genom att tillsätta 3 ml förvärmd kvinnlig könsstympning3 till kolven. Pipettera sedan lösningen upp och ner mot kolvens botten för att lossa CFs.
- Samla cellfjädringen i ett 15 ml mikrocentrifugrör. Ta 10 μL av cellupphängningen och dispensera den i en hemocytometer för att räkna cellerna med ett mikroskop.
- Centrifugera cellfjädringen vid 200 x g i 4 min. Aspirera supernaten som är försiktig så att cellpelleten inte störs.
- Återanvänd pelleten i färsk FGM3 för att göra önskade 75 x 106 celler/ml. Antingen passage en del (250K celler per T75 kolv) eller följ nedanstående protokoll för att generera 3D hjärtvävnad.
- CM-dissociation
OBS: Efter differentiering och rening bereder du CMs för användning i injektionen i mikrofluidiska enheter.- Ta ut plattan på CMs ur inkubatorn och aspirera på mediet. Tvätta sedan brunnarna med 1 ml 1x DPBS per brunn på en 6-brunnsplatta. Ta 6 ml DPBS och pipett 1 ml per brunn.
- Aspirera DPBS var försiktig så att de inte stör cellerna som är fästa vid plattan. Pipett 6 ml varm cellavlossningslösning (t.ex. TrypLE express) och tillsätt 1 ml per brunn. Inkubera cellerna i en inkubator på 37 °C i 10 minuter.
- Neutralisera enzymet med en lika stor volym RPMI + B27+ insulin (dvs. 1 ml per brunn) och dissociera cellerna mekaniskt genom att pipettera upp och ner mot odlingskärlet med en 1 ml pipett.
- Samla CMs i ett 15 ml centrifugeringsrör. Centrifugera vid 300 x g i 3 min.
- Aspirera supernaten. Återanvänd cellpelleten i 5 ml RPMI + B27 + insulin. Pipett lösningen upp och ner med en 1 ml pipett för att säkerställa korrekt blandning. Ta 10 μL av cellfjädringen och dispensera den i en hemocytometer för att bestämma det totala cellnumret.
- Centrifugera cellerna igen vid 300 x g i 3 min (för att säkerställa fullständig borttagning av TrypLE) och aspirera supernatanten. Tillsätt sedan en lämplig volym RPMI + B27 + insulin för att uppnå 75 x 106 celler/ml.
OBS: Om hjärt differentiering/urval inte resulterar i hög CM% (dvs. >80%), vilket framgår av immunostaining eller flöde cytometri för CM-specifika proteiner som cTnT, anser inte celler som lämpliga för vävnadsbildningen. Differentieringsprocessen bör optimeras när detta sker genom justering av CHIR99021-koncentrationer och initial starttäthet. Om CM-rening behöver förbättras kan andra metoder användas, till exempel sortering för CMs med antingen fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) eller magnetiskt aktiverad cellsortering (MACS)30,31,32.
- Kollagenberedning
OBS: Förbered kollagen från den höga koncentrationen av kollagenlager (från 8-11 mg/ml). Kollagenet som används för att skapa cellen: hydrogelblandningen är vid 6 mg/ml och den slutliga koncentrationen är 2 mg/ml. Beroende på antalet enheter att injicera måste volymen av kollagenlösningen som ska göras beräknas tillbaka.- Förvara alla nödvändiga reagenser på is inuti en biosäkerhetshuv.
OBS: Kollagen är en termoresponsiv hydrogel. Därför måste temperaturen förbli låg för att förhindra för tidig polymerisation. - Ta 75 μL lagerkolagen (8 mg/ml) och dela ut det i ett mikrocentrifugrör på is. Kollagenlösning är mycket trögflytande, så aspirera den långsamt med en pipett.
- Ta 13,85 μL media (dvs. RPMI + B27 + insulin) och dispensera det i samma rör.
- Ta sedan 10 μL fenolrött och tillsätt till blandningen och återanvänd.
- Slutligen, ta 1,15 μL 1N NaOH och lägg till suspensionen.
- Använd en 200 μL pipettspets och återanvänd suspensionen.
OBS: Stockkolagen har ett surt pH, vilket kräver tillsats av NaOH för att neutralisera innan det används för att kapsla in hjärtcellerna. Fenolrött fungerar som en pH-indikator; Lägg därför till detta innan NaOH-tillägget. Vid denna tidpunkt kommer kollagenlösningen att vara gul och beteckna dess surhet. Efter tillsats av NaOH bör lösningen bli orange till ljusrosa, vilket indikerar dess neutralisering.
- Förvara alla nödvändiga reagenser på is inuti en biosäkerhetshuv.
- Hydrogelblandning och cellberedning
OBS: I detta steg görs inkapslingen av cellerna i den kollagenbaserade hydrogelen. Cellerna, liksom alla hydrogelprekursorer, bör placeras på is under nästa steg.- Om CFs ännu inte har provats, förvara CM-fjädringen i ett 15 ml centrifugrör, med locket skruvat för att möjliggöra gasflöde, inom en inkubator på 37 °C. Samtidigt tar du avstånd från CFs och samlar in med en densitet på 75 x 106 celler/ml för enhetsbelastning.
- Blanda de upphängda CMs med CFs med ett 4:1-förhållande. Ta en alikvot på 8 μL CMs och lägg till ett nytt centrifugeringsrör på is. Ta sedan 2 μL CFs och lägg till cellfjädringen i centrifugröret.
- Återanvänd cellfjädringen, ta tag i 5,6 μL av cellfjädringen och lägg den i ett nytt mikrocentrifugrör.
- Ta 4 μL av kollagenet som bara förberetts i ovanstående steg och lägg till en 4:1 CM: CF-blandning. Tillsätt 2,4 μL tillväxtfaktorreminerade (GFR) källarmembranmatris, vilket gör den slutliga celltätheten som 35 x 106 celler/ml för enhetsinjektionen. Pipetten blandningen upp och ner för att säkerställa att cellfjädringen är homogen.
- Enhetsinfogning
OBS: När cellen:hydrogelblandningen är beredd måste den sättas in i enheterna.- Ta ut autoklaverade mikrofluidiska anordningar ur ugnen på 80 °C och ställ in dem i Biosafety Cabinet i minst 1 timme före cellfjädringsinsättningen så att enheterna kan svalna till rumstemperatur samtidigt som steriliteten bibehålls.
- Placera enheterna i 60 x 15 mm Petri-rätter, på 3-4 enheter per maträtt. Fyll en 150 x 15 mm Petriskål med ett tunt lager DI H2O för att hålla 3 av de 60 x 15 mm Petri-diskarna. Det här steget skapar en fuktad miljö som omger mikrofluidiska enheter.
- Använd en ny spets och återanvänd cellen:hydrogelblandningen noggrant genom att pipetting suspensionen medan röret förblir på is.
- För in spetsen i enhetens injektionsport och injicera långsamt och stadigt 3 μL av cellen: hydrogelupphängning i vävnadsregionens inlopp av en mikrofluidisk anordning med en 20 μL pipettspets. När porten är fylld, stoppa injektionen och ta bort spetsen. Upprepa för alla enheter, eller hela den beredda hydrogelupphängningen.
OBS: Cellens lilla volym:hydrogelfjädringen värms upp/svalnar mycket snabbt, så det är relevant att hålla suspensionen på is så länge som möjligt. Vid föring, pipett lösningen av isen och sätta in i enheter så snabbt som möjligt, eftersom hydrogelen kan börja polymerisera i pipettspetsen. Det är viktigt att skapa små volymer av cellen: hydrogelupphängning åt gången, så om många enheter ska injiceras måste cellen:hydrogelupphängningen göras färsk för varje uppsättning av 4 enheter. - Vänd enheterna i sina Petri-rätter med pincett och placera dem i den stora Petri-skålen med vatten. Inkubera i en inkubator på 37 °C i 9 minuter för hydrogelpolymerisering.
- Ta ut apparaterna ur inkubatorn, vänd enheterna upprätt och inkubera vid 37 °C i 9 minuter för att slutföra hydrogelpolymeriseringen.
- Injicera RPMI + B27 + insulin i de flankerande mediekanalerna (~ 20 μL per enhet). Placera tillbaka apparaterna i inkubatorn vid 37 °C. Byt media inom mediekanalerna med färskt RPMI + B27 + insulin varje dag. Enheterna har visat sig vara odlade från 14-21 dagar20.
OBS: På grund av den lilla medievolymen per chip, för att förhindra avdunstning av media, är det viktigt att hålla enheterna i en stor Petri-skål fylld med DI H2O, som fungerar som en fuktad kammare. Dessutom kan små droppar överskott av RPMI + B27 + insulin pipetted på toppen av kanalens inlopp / utlopp under rutinmässiga medieförändringar.
4. Vävnadsanalys
-
Live-bildbehandling
OBS: All levande avbildning ska utföras med en sceninkubator för att bibehålla 37 °C och 5 % CO2.- Placera apparaterna i en miljöstyrd sceninkubator. Spela in 30 s videor av flera platser i varje enhet med maximal bildhastighet.
- För att bedöma vävnadskontraktilitet efter att ha extraherat slagsignalerna, använd den kompletterande specialskrivna MATLAB-koden för att extrahera toppar(kompletterande fil 2) för beräkning av inter-beat intervallvariation.
- Ändra media i enheter i cellkulturhuven och placera sedan tillbaka i cellkulturinkubatorn.
-
Immunofluorescerande färgning
- Förbered PBS-glycin: Lös upp 100 mM glycin i PBS och tillsätt 0,02% NaN3 för långtidslagring. Justera pH till 7,4.
- Förbered PBS-Tween-20: Lägg till 0,05 % interpolering-20 till PBS och lägg till 0,02 % NaN3 för långtidslagring. Justera pH till 7,4.
- Förbered OM-buffert: Lägg till 0,2 % Triton X-100, 0,1 % BSA och 0,05 % interpolering-20 i PBS och lägg till 0,02 % NaN3 för långtidslagring. Justera pH till 7,4.
- Bered 10% getserum: Återanvänd det lyofiliserade getserumet i 2 ml PBS för att göra 100% getserum. Späd sedan ut 2 ml med 18 ml PBS för att göra 10% getserum.
- Fixera proverna genom att tillsätta 4% paraformaldehyd (PFA) i vävnadskanalerna och inkubera vid 37 °C i 20 min.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta PBS-glycin i vävnadskanalerna 2x i 10 min inkubation vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna genom att lägga till PBS -Tween-20 i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Permeabilisera cellerna genom att tillsätta IF-buffert till vävnadskanalerna i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Blockera cellerna genom att tillsätta 10% getserumlösning till vävnadskanalerna i 1 timme vid rumstemperatur.
- Späd ut de icke konjugerade primära antikropparna i 10% getserum vid önskade koncentrationer (se kompletterande fil 3),lägg till vävnadskanalerna och inkubera proverna vid 4 °C över natten.
- Tvätta proverna följande dag genom att tillsätta PBS-Tween-20 i vävnadskanalerna 3x i 20 minuter vardera vid rumstemperatur.
OBS: Från steg 4.2.12 och framåt utför du alla uppgifter i mörker, så att proverna skyddas mot ljus. - Späd de sekundära antikropparna i PBS-Tween-20 vid önskade koncentrationer, centrifug vid 10 000 x g i 10 minuter för att samla in eventuella fällningar och lägg sedan till vävnadskanalerna.
- Efter 30 min-1 h, tvätta proverna med PBS-Tween-20 3x i 10 min vardera vid rumstemperatur.
- Tillsätt anti-blekning eller önskat monteringsmedium till vävnadskanalerna. Sedan kan proverna avbildas med fluorescensmikroskopi eller med ett konfokalt mikroskop, om högre förstoring önskas. För att visualisera hela 3D-vävnaden kan bilder på olika z-plan staplas och rekonstrueras för att bilda representativa 3D-bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att erhålla en mycket renad population av CMs från hiPSCs används en modifierad version som omfattar en kombination av Lian differentieringsprotokoll33 och Tohyamareningssteg 34 (se figur 1A för experimentell tidslinje). HiPSCs måste vara koloniliknande, ~ 85% konfluenta och jämnt spridda över hela kulturbrunnen 3-4 dagar efter passagen, vid början av CM-differentiering (Figur 1B). Specifikt, på dag 0, hiPSC kolonier bör ha ett högt uttryck för pluripotency transkription faktorer, inklusive SOX2 och Nanog (Figur 1C). Baserat på detta protokoll visas bevis på en framgångsrik stamcellsdiversifierings- och reningsprocess i figur 1D, med täta kolonier av CMs som uttrycker sarkomisk α-aktinin, med minimala omgivande icke-CMs. Dessutom måste hCFs upprätthålla en fibroblastmorfologi med högt vimentinuttryck (figur 1E), så de ska användas före P10 eftersom de kan börja skilja sig åt myofibroblaster vid högre passager29.
För att upprätthålla protokollets robusta karaktär är det relevant att genomföra omparning av hiPSC-CMs efter metabolisk rening. På grund av närvaron av döda celler och skräp som uppstår från glukossvält behöver CMs ytterligare ett reningssteg för att maximera CM-renhet och hälsa före användning i experimentet; Därför används replering eftersom det hjälper till att lossa skräpet / döda icke-CMs (Figur 2A-B, Videor 1-2). Video 1 visar en exempelpopulation av CMs innan de replerar, presenterar med en hög renhet av CMs i flera lager, men med mycket skräp närvarande på cellerna och flytande i media på grund av den implementerade reningen. På motsvarande sätt visar Video 2 samma population av CMs omedelbart efter omvärdering, presenterar CMs i en monolayer med betydligt mindre skräp, visar effekterna av vävnads matsmältning och encellig dissociation som uppstår under omvärdering.
Vid införandet av den cellinbäddade hydrogelen i den mikrofluidiska enheten (dvs. chip; insetbild i figur 3)är cellerna täta och jämnt fördelade över stolparna. Cellerna börjar spridas dag 1 (Figur 3A), sedan vid dag 7 återupptar de misshandeln och blir mer synkron i sina kontraktila mönster (Figur 3B). Dessutom kondenserar 3D-vävnaderna runt stolparna för att bilda upprepande elliptiska porer och cellerna försträcks. Dag 14 uppvisar de mogna vävnaderna en hög grad av anisotropi (dvs. riktad organisation), bestående av celler med långsträckt form (figur 3C, 4A), strimmiga, justerade sarkomerer och lokaliserade gapkorsningar (Figur 4B). Dessutom är de spontana kontraktila mönstren hos dessa vävnader mycket synkron (figur 4C, Video 3) på grund av hjärtcellernas sammankopplade, anpassade natur.
Figur 1:Experimentella schematiska och representativa bilder av cellulär morfologi under förberedelsen av enhetsinjektion: Schematisk av protokollet, som beskriver steg efter mikrofluidisk anordningstillverkning, från hiPSC-kultur till mikrofluidisk hjärtvävnadsbildning (A). HiPSCs bör upprätthålla en koloniliknande morfologi(B)och ett högt uttryck för pluripotensmarkörer (SOX2, grön; Nanog, röd) (C) på uppkomsten av differentiering. Efter hiPSC-CM differentiering bör det finnas rikliga, täta fläckar av CMs, som färgas med sarkomisk alfa-aktinin (SAA, grön), med minimala omgivande icke-CMs, vilket framgår av vimentin färgning (vim, röd) (D). hCFs bör presentera med höga nivåer av vimentin uttryck och upprätthålla fibroblast morfologi (E). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:HiPSC-CM-populationer under de senare differentieringsstadierna: Reningsprocessen orsakar icke-CMs död och producerar skräp i cellkulturen, som finns före CM-omvärdering (A). Efter omgruppering (B) lossas skräpet och icke-CMs, vilket tjänar till att ytterligare rena CM-populationen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Vävnadsbildning av humant hjärt-3D-vävnad i den mikrofluidiska enheten: Dagen efter injektionen i enheten (visas i övre vänstra inset, bredvid US dime för skala), börjar cellerna spridas och kommer att vara täta och homogent fördelade över hela enheten (A). Efter en veckas kultur kommer cellerna att återuppta spontant slå och bilda kondenserade, justerade vävnader (B). Med två veckors kultur bildar cellerna kondenserade, justerade vävnader runt de elliptiska stolparna (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa egenskaper hos mänsklig hjärtvävnad efter odling i 14 dagar i den mikrofluidiska anordningen: Cellerna har bildat långsträckta, mycket justerade vävnader, betecknade med aktinfärgning (A). Sarkomerna är parallella och strimmiga, och det finns lokalisering av gap korsningar som framgår av färgning för sarkomisk α-aktinin (SAA) respektive connexin 43 (CX43), respektive (B). Den spontana sammandragningen är synkron (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Spontan sammandragning av hiPSC-CMs på dag 21 efter laktat rening och innan du replerar Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Spontan sammandragning av hiPSC-CMs på dag 23 efter omgivande Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Synkron, spontan sammandragning av mänsklig hjärtvävnad inom enheten i 14 dagar Klicka här för att ladda ner denna video.
Kompletterande akt 1: AutoCAD fil för hjärta på-ett-chip enhet Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande akt 2: MATLAB-program för att extrahera toppar för att bestämma inter-beat intervallvariation från att slå signaler Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande akt 3: Tabell över primära och sekundära antikroppar Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bildandet av en in vitro mänskliga hjärtvävnad modell med förbättrade cell-cell interaktioner och biomimetisk 3D struktur är absolut nödvändigt för grundläggande kardiovaskulär forskning och motsvarande kliniskatillämpningar 1. Detta skisserade protokoll förklarar utvecklingen av 3D mänskliga anisotrop hjärt vävnad inom en mikrofluidic enhet, med hjälp av samkultur av stamcell-härledda CMs med bindväv inkapslade i en kollagen hydrogel, tjänar till att modellera den komplexa cell sammansättningen och strukturen i det inhemska hjärtmuskeln. Detta specifika protokoll är mycket reproducerbart, eftersom enhetens särskilda struktur har optimerats och validerats för 3D anisotrop hjärtvävnadsbildning från både rått-härledda hjärtceller och mänskliga stamcellsdifferentierade CMs, från hESCs, och två typer av hiPSCs (SCVI20 och IMR90-4) som visas i vår senastepublikation 20. Vi har bland många andra grupper funnit att effektiviteten av CM-differentiering av stamceller varierar mellan cellinjerna35,36. Det implementerade reningsprotokollet bidrar till att öka differentieringsutbytet. Reningstidens längd är dock beroende av cellinje och differentieringseffektivitet. Därför kan den resulterande framgången i bildandet av mikrofluidvävnaderna variera mellan cellinjer.
För att fånga relevanta komponenter i hjärtmuskeln är cellsammansättningen för de demonstrerade vävnaderna främst en blandning av CMs och CFs, eftersom CMs äventyrar det mesta av volymen medan CFs behåller större delen av cellpopulationen i hjärtat37. Dessutom validerades det särskilda förhållandet 4:1 CM:CFs i stor utsträckning i nyligen publicerade arbete20 för att resultera i optimal struktur och hjärtvävnadsbildning inom denna plattform. Framtida studier som involverar denna beskrivna plattform kan främjas ytterligare i sin komplexitet genom tillskott med andra ångerfulla celltyper för att bättre efterlikna det inhemska myokardiet. Till exempel har det nyligen visat sig att bosatta makrofager är integrerade i resistionsprocesser inom hjärtat38, förutom deras väldokumenterade roll i immunsvar39. Därför kan makrofager införlivas i cellblandningen före hydrogel inkapsling till modell bosatta hjärt makrofager. Alternativt kan monocyter levereras via mediekanalerna som en modell för rekrytering genom blodcirkulationen, vilket kan leda till en population av inflammatoriska makrofager i hjärtvävnaden.
Det finns inneboende fördelar med att använda en mikrofluidisk enhet som en plattform för att konstruera 3D-vävnadsmodeller. Särskilt exakta diffusionsbaserade experiment kan fastställas genom exakt kontroll av kemikalier, molekyler eller gaser som möjliggör koncentrationsgradienter över enenhet 18,20. Dessutom kan olika uppsättningar av celltyper40 och vätskeflöde införlivas för att efterlikna dynamiska odlingsförhållanden och ge savspänning på sådda celler41. Det senare kan vara till särskild nytta vid studier av ett inkorporerat kärlsystem i chipet, eftersom endotelceller kan sås i de intilliggande mediekanalerna (som vi tidigare har visat med hjälp av denna enhet för att modellera astrocyter-på-ett-chip23), och konstant vätskeflöde för att efterlikna kapillärer kan enkelt införlivas via en vakuumbaserad eller gravitationsbaserad pump.
En annan fördel med den mikrofluidiska enheten är det material (dvs. PDMS) som används för att tillverka enhetskanalerna. Specifikt är PDMS en transparent, billig och biokompatierbar polymer42 med lätt justerbar styvhet. Det begränsande steget i tillverkningen av dessa enheter ligger i fotolitografin, eftersom tekniken kräver tillgång till ett rent rum och förvärv av den tillhörande färdigheten. Men när skivan är tillverkad kan den användas för att göra hundratals enheter genom den raka mjuka litografiprocessen för att skapa PDMS-kanalerna och den enkla plasmabindningen för att försegla kanalerna till täcklips. I framtida studier, om enheten skulle modifieras för att inkludera förmågan att mäta vävnadens elektriska egenskaper i realtid, skulle ytterligare ett steg för att passa enheten med elektroder och ledande komponenter behöva införlivas i tillverkningsprocessen. Användningen av PDMS för att tillverka kanalen kan behålla begränsningar, särskilt om de används i konstruktioner för läkemedelsresponsstudier, eftersom PDMS har visat sig adsorbera små hydrofobiskamolekyler 43,44,45. Därför kan andra material, såsom termoplaster46,47, undersökas som alternativ till PDMS under den mjuka litografiprocessen.
Ett kritiskt steg i det här skisserade protokollet är steg 3.6.4 som beskriver cell:hydrogelinsättning i mikrofluidiska enheter. Några viktiga variabler måste kontrolleras för att säkerställa framgång, inklusive temperatur, tid och korrekt hantering. Om antingen hydrogelbeståndslösningarna eller den beredda cellen:hydrogellösningen når rumstemperatur riskerar de att delvis polymeriseras, vilket är oåterkalleligt, vilket gör lösningen trögflytande och nästan omöjlig att injicera i enheten utan läckage i mediekanaler. Å andra sidan kan cellen:hydrogellösningen inte frysa, eftersom cellerna kommer att dö; Lösningen måste därför bibehållas inom detta smala temperaturfönster. På samma sätt avser den tid som förfluter mellan cell:hydrogelpreparat och produktinjektion direkt den förberedda lösningens ökande temperatur. Specifikt, så snart lösningen är gjord och alikvoten (dvs. 3 μL) erhålls, måste pipetten som håller alikvoten flyttas, så spetsen är inuti enhetens portar, och alikvoten ska långsamt och stadigt sättas in i enheten. Under hela denna övergång ligger den lilla volymen inom en pipettspets som är vid rumstemperatur, därför ökar lösningen snabbt temperaturen från den is som den förbereddes på (dvs. -20 °C), vilket kräver en ganska snabb injektionsprocess. Om temperaturkänsligheten hos den kollagenbaserade hydrogelen blir en nyckelfaktor under enhetsinjektionen kan införlivandet av andrahydrogeler 48, såsom fotocrosslänkbara hydrogeler (dvs. GelMA)47,49,50,51 eller enzymatiskt korslänkade hydrogeler (dvs. fibrin)11,52,53, utforskas.
Utformningen av den mikrofluidiska enheten som ingår i detta protokoll möjliggör upprättandet av en anisotrop vävnad på grund av närvaron av de förskjutna, utskjutande elliptiska inläggen inom huvudvävnadskanalen20. Den här funktionen är fördelaktig jämfört med andra metoder, till exempel ECM-kontaktutskrift, eftersom det inte kräver ett hanteringssteg för att skapa topografin som kan leda till variation mellan prover på grund av stämpeldeformation eller bläckdiffusion54. Men som nämnts tidigare finns det ofta svårigheter med injektion av en cell: hydrogel suspension i en enhetskanal, särskilt i en kanal med medfödda inlägg. I detta syfte är hanteringstrycket för enhetsinsättning ganska känsligt. Injektionsprocessen måste vara stabil, vid ett konsekvent och relativt lågt tryck för att undvika läckage i mediekanalerna.
Dessutom kan bubblor inte införas vare sig under beredningen av lösningen eller under enhetsinsättningen, eftersom bubblor kommer att orsaka läckage från huvudvävnadskanalen till mediekanalerna. Således behövs korrekt vård för att kontrollera hantering, temperatur och timing av cellen: hydrogelinjektion för att säkerställa framgången i bildandet av 3D homogent fördelad vävnad. Därför kan det vara fördelaktigt att öva på att hantera mikrofluidiska enheter före cellkulturexperiment. Underhåll därefter av vävnader inom mikrofluidiska enheter är ganska enkelt, vilket helt enkelt kräver en daglig medieförändring på 20 μL-volym, och enhetens täckplatta-bas gör bekväm hantering under avbildning i realtid.
Sammanfattningsvis använder protokollet som beskrivs häri en kombination av mikromolding tekniker, inklusive fotolitografi och mjuk litografi, för att skapa en invecklad arkitektur inom en mikrofluidisk enhet som inducerar höga nivåer av 3D vävnad anisotropy, med robusta biologiska tekniker, inklusive stamcells differentiering, primära mänskliga cellkultur och hydrogelbaserade biomaterial. Slutresultatet av det skisserade protokollet är en justerad, 3D-odlad hjärtvävnad i ett mikrofluidiskt chip med en mogen fenotyp, som upprepade gånger har validerats för flera olika celltyper ochlinjer 20, vilket gör den lämplig för sjukdomsmodellering och prekliniska applikationer nedströms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) och Flinn Foundation Award för att ha tillhandahållit finansieringskällor för detta projekt. HiPSC-linjen, SCVI20, erhölls från Joseph C. Wu, MD, phd vid Stanford Cardiovascular Institute finansierad av NIH R24 HL117756. HiPSC-linjen, IMR90-4, erhölls från WiCell Research Institute55,56.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
| 1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
| 1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
| 18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
| 6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
| B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
| B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
| CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
| DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
| DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
| E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
| EDTA | VWR | 45001-122 | |
| Ethanol | |||
| FGM3 | VWR | 10172-048 | |
| GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
| Glycine | Sigma | G8898-500G | |
| Goat serum | VWR | 10152-212 | |
| hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
| IPA | |||
| IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
| Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
| MTCS | Sigma | 440299-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
| Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
| Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
| RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
| Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
| Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
| SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
| Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
| T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| EVG620 Aligner | EVG | ||
| Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
| Leica SP8 Confocal microscope | Leica |
References
- Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
- Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147 (2012).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033 (2020).
- Pinto, A. R., et al.
- LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, Springer. Parts of the Developments in Cardiovascular Medicine book series 3-21 (2005).
- Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29 (2019).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397 (2011).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
- Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
- Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
- Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105 (2017).
- Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883 (2015).
- Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741 (2020).
- Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195 (2020).
- Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 7, 3139-3151 (2019).
- Benam, K. H., et al.
- Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810 (2020).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
- Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
- Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809 (2020).
- Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
- Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657 (2011).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
- Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
- Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
- Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells - Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
- Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
- van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
- Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
- Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
- Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133 (2020).
- Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
- Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
- Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
- Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
