Som for tiden implementert, krever optogenetikk i ikke-menneskelige primater injeksjon av virale vektorer i hjernen. En optimal injeksjonsmetode bør være pålitelig og, for mange applikasjoner, i stand til å målrette mot individuelle steder med vilkårlig dybde som lett og entydig identifiseres i postmortem histologi. En injeksjonsmetode med disse egenskapene presenteres.
Optogenetiske teknikker har revolusjonert nevrovitenskapelig forskning og er klar til å gjøre det samme for nevrologisk genterapi. Den kliniske bruken av optogenetikk krever imidlertid at sikkerhet og effekt påvises i dyremodeller, ideelt sett hos ikke-humane primater (NHPs), på grunn av deres nevrologiske likhet med mennesker. Antallet kandidatvektorer som er potensielt nyttige for nevrovitenskap og medisin er stort, og ingen høy gjennomstrømningsmidler for å teste disse vektorene eksisterer ennå. Dermed er det behov for teknikker for å lage flere romlig og volumetrisk nøyaktige injeksjoner av virale vektorer i NHP-hjernen som kan identifiseres entydig gjennom postmortem histologi. Beskrevet her er en slik metode. Injeksjonskanyler er konstruert av koblede polytetrafluoretylen og rustfritt stålrør. Disse kanylene er autoklaverbare, disponible og har lave minimale belastningsvolumer, noe som gjør dem ideelle for injeksjon av dyre, høykonsentrerte virale vektorløsninger. En inert, rødfarget mineralolje fyller dødrommet og danner en synlig menisk med vektorløsningen, noe som muliggjør øyeblikkelig og nøyaktig måling av injeksjonshastigheter og volumer. Oljen lastes inn i baksiden av kanylen, noe som reduserer risikoen for samtidig injeksjon med vektoren. Kanyler kan lastes på 10 minutter, og injeksjoner kan gjøres på 20 minutter. Denne prosedyren er godt egnet for injeksjoner i våkne eller bedøvede dyr. Når den brukes til å levere virale vektorer av høy kvalitet, kan denne prosedyren produsere robust uttrykk for optogenetiske proteiner, noe som muliggjør optisk kontroll av nevral aktivitet og oppførsel i NHPs.
Optogenetikk i ikke-menneskelige primater (NHPs) innebærer vanligvis injeksjon av viral vektor direkte inn i hjernen. En klasse vektorer som er godt egnet for denne applikasjonen er basert på adeno-assosiert virus (AAV). Disse vektorene består av et proteinkapsid som omgir et enkeltstrenget DNA-genom som igjen består av en promotor, et opsin-gen og eventuelt andre proteinkodende og genregulerende elementer. Fremskritt innen molekylær kloning har gjort det lettere å manipulere og kombinere disse komponentene for utvikling av nye vektorer. Følgelig er samlingen av AAV-vektorer som potensielt er nyttige for NHP optogenetikk stor og vokser raskt.
For tiden krever nytten av en AAV-vektor for NHP optogenetikk testing in vivo. Dette faktum er en betydelig barriere for fremgang. Dyr må brukes sparsomt, og testing av flere vektorer i et enkelt dyr krever at injeksjonssteder plasseres fornuftig i forhold til nevral arkitektur og godt separert i forhold til viral spredning. Nøyaktig histologisk vurdering krever at injeksjonene er romlig og volumetrisk nøyaktige. En injeksjonsteknikk som tidligere ble brukt til fokal levering av farmakologiske midler 1,2,3,4 ble tilpasset og forenklet for å gjøre slike injeksjoner. Denne injeksjonsteknikken er billig, bruker engangs, steriliserbare komponenter, kan brukes i bedøvede eller våkne oppførende aper, og kan brukes til å målrette mot ulike hjerneområder av hvilken som helst dybde. Følgende protokoll beskriver trinnvise prosedyrer for fremstilling av engangskomponentene og injeksjoner i NHP-hjernen. Fordelene og ulempene ved teknikken diskuteres.
Fremskritt innen NHP optogenetikk har skapt et behov for nøyaktige, pålitelige intrakranielle injeksjonsmetoder. Fordelene med metoden beskrevet i denne rapporten er at den er billig, bruker steriliserbare og engangskomponenter, og har evnen til å målrette mot ulike hjerneområder av hvilken som helst dybde. Det tillater også kontroll av injeksjonshastighet og volum i kraft av hastigheten som luftventilen kan styres med. Lufttrykket kan økes midlertidig for å løsne en tresko og deretter reduseres raskt for å unngå påfølgende overinjeksjon som vil bli produsert ved vedvarende trykk. Engangskomponenter reduserer risikoen for krysskontaminering mellom injeksjonsstedene.
Kritiske trinn i denne injeksjonsprotokollen inkluderer å konstruere kanyler av høy kvalitet, laste dem uten å introdusere bobler og velge injeksjonssteder som ikke er for nær hverandre. Injeksjoner ≥1 cm fra hverandre transduserer vanligvis ikke-overlappende regioner, men denne heuristikken er avhengig av viral serotype, titer, promotor, volum, mål og metode for deteksjon. Ved å velge injeksjonssteder som ikke er direkte tilkoblet, unngår man potensielle forstyrrelser forårsaket av opsinhandel langs aksoner og tilbøyeligheten til noen AAV-serotyper for retrograd transduksjon.
Metoden kan brukes til å injisere NHP mens de er bedøvet og i en stereotaksisk ramme (figur 3) eller våken og hodefestet (figur 4). Førstnevnte har fordelen av å tillate injeksjoner å bli målrettet i stereotaksiske koordinater, og det tillater visuell bekreftelse av kanylepenetrasjon gjennom en akutt durotomi (incising dura i en våken ape, gjennom kronisk kraniotomi, øker risikoen for infeksjon). Sistnevnte tilnærming har fordelene ved å redusere antall overlevelsesoperasjoner og dermed stresset til dyret, være kompatibelt med elektrofysiologiske opptak under oppførsel, og bruke samme koordinatramme og instrumentering som brukes til å sette inn optiske fibre for eksperimenter etter injeksjon. Injeksjonsteknikken hos våkne aper kan forbedres ytterligere ved å lage injeksjoner gjennom kunstig dura13,14,15. Dette vil gi de ekstra fordelene med direkte visualisering av injeksjonssteder og vevsfluorescens som indikerer vellykket transduksjon.
Flere andre AAV-injeksjonsteknikker har blitt brukt i NHPs. Nylig ble en flerkanals injeksjonsenhet utviklet for å levere AAV-vektorer jevnt til store NHP-kortikale regioner16. Lignende resultater kan oppnås ved bruk av konveksjonsforbedret levering17,18. Disse metodene tar sikte på å maksimere transduksjonsspredningen, som er et viktig mål, men et som er forskjellig fra den romlige presisjonen vår metode tar sikte på å oppnå.
En annen alternativ metode er å injisere AAV-vektorer gjennom borosilikatrør som er skråstilt til en skarp spiss i den ene enden og festet til en Hamilton-sprøyte på den andre 5,6. Denne metoden har mye til felles med metoden beskrevet i denne artikkelen. Den virale vektoren holdes i en lengde av rør, rommet i slangen bak viruset er fylt med farget olje, og strømmen av vektoren overvåkes via bevegelsen av oljevektormenisken. Denne alternative teknikken krever mindre utstyr og forberedelse, men det krever å trekke olje inn i borosilikatrøret gjennom den skrå spissen ved negativt trykk og lasting av vektoren via samme rute senere. Dette resulterer uunngåelig i spor av olje levert til hjernen. I tillegg, etter vår erfaring, må borosilikatslangen ha en diameter på ~ 350 μm for å trenge inn i dura selv når den er skrå og forårsaker derfor større mekanisk skade enn den tynnere metallkanylen beskrevet i dette papiret (figur 2D). 30 G-rør ble brukt fordi den kritiske knekkebelastningen er høy nok til å formidle dura-penetrasjon til tross for en lengde på 1-10 cm, fordi den passer godt til PTFE-slangen, og fordi den sjelden blir blokkert. 33 G-slangen tetter og bøyes lettere og er vanskeligere å pare med PTFE-slangen. 36 G rør er utilstrekkelig stiv til å trenge inn i NHP dura mater.
En annen alternativ injeksjonsteknikk er å mate utgangen fra luftpumpen til en bakside av en vektorbelastet, trukket glasspipette19. Vektoren tvinges fra pipettespissen ved direkte, intermitterende lufttrykk fra pumpen, noe som eliminerer behovet for olje. I likhet med enkeltrørsmetoden som er forklart ovenfor, reduserer mangelen på materielle kryss mellom menisken og kanylespissen risikoen for lekkasjer. Imidlertid hindrer de skarpe taperene og delikate spissene av glasspipetter dem i å trenge inn i NHP-dura eller målrette mot dype strukturer.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av WaNPRC / ITHS P51OD010425 (JTT), National Institute of Health (NIH) tilskudd EY023277 (R01 for YK), EY030441 (R01 for GH), MH114126 (RF1 til JTT, Boaz Levi, Ed Lein), MH120095 (UG3 for JTT og GH), EY028902 (R01 for RS), og muliggjort av NIH-tilskudd OD010425 (P51 for WaNPRC) og University of Washington Royalty Research Fund A148416. Forfatterne vil takke Yasmine El-Shamayleh og Victoria Omstead for histologi, Refugio Martinez for viral vektorkloning og John Mich for hjelp med NHP hjernevevsbehandling.
Equipment: Stereotaxic set | |||
Item | |||
Allen keys | BONDHUS | 10936 | STERRAD |
Cannula holder | KOPF | 1770 | STERRAD |
Carrier (manipulator) | KOPF | 1404 | STERRAD |
Carrier platform | KOPF | 1430 | NA |
Carrier stand | KOPF | 1449 | STERRAD |
Eye, ear, mouth bars | KOPF | 1430 | NA |
Stereotaxic base | KOPF | 1210 | NA |
Equipment: Cannula | |||
Item | |||
1 mL Luer-lock syringes | BD | 309628 | NA (sterilized package) |
Cannulas* | (homemade – see below) | NA | steam (autoclave) |
Colored oil** | (homemade – see below) | NA | NA |
Elevator (for tube rack) | Cole-Parmer | UX-08057-10 | STERRAD |
Filter tip | Genesee Scientific | 23-404 | NA (sterilized package) |
Fluorescent microbeads | Lumafluor | R170 | NA |
P20 pipetman | Gilson | FA10003M | NA |
PCR tubes | Olympus Plastics | 22-161 | STERRAD |
Stopcock | Cole-Parmer | 3060004 | STERRAD |
Tube rack | homemade | NA | STERRAD |
Vector solution | (homemade) | NA | NA |
Equipment: Electric air pump set | |||
Item | |||
Electric air pump | World Precision Instruments | PV830 | NA |
Foot pedal | World Precision Instruments | 3260 | NA |
Tube cover | EZ Drape | A400-1000 | NA (sterilized package) |
Equipment: General surgery tools | |||
Item | |||
Beaker | MEDLINE | azlon | STERRAD |
Burrs | STRYKER | 277-10-235 | STERRAD |
Double pronged tissue pick | Fine Science Tools | 18067-11 | STERRAD |
Drapes | MEDLINE | DYNJP3004 | NA (sterilized package) |
Dressing forceps | Miltex | 6-118 | STERRAD |
Drill | STRYKER | Q9R-5400 | NA |
Drill bits | STRYKER | 277-82-87 | STERRAD |
Gauze | MEDLINE | NON26334 | NA (sterilized package) |
Hemostatic mosquito forceps | Miltex | 7-2, 7-4 | STERRAD |
Light handles | SKYTRON | Stellar XL | STERRAD |
Needle hodler | Miltex | 8-2 | STERRAD |
Periosteal elevator | Miltex | 18-1968 | STERRAD |
Rongeurs | Miltex | 17-4800 | STERRAD |
Saline | BAXTER | 2F7122 | STERRAD |
Scalpel | Bard-Parker | 372610 | STERRAD |
Scissors | Miltex | 5-12, 5-114 | STERRAD |
Senn retractors | Miltex | 28065 | STERRAD |
Sterile gloves | MEDLINE | Triumph Micro | NA (sterilized package) |
Suction | medela | 200-4869 | NA |
Suction tip | MEDLINE | DYNDFR12S | NA (sterilized package) |
Suction tube | COVIDEN | 8888301614 | NA (sterilized package) |
Surgical gowns | MEDLINE | DYNJP2002S | NA (sterilized package) |
Surgical pens & ruler | MEDLINE | DYNJSM03 | NA (sterilized package) |
Suture | COVIDEN | SL-635 | NA (sterilized package) |
Tissue forceps | Miltex | 6-114 | STERRAD |
Towel clamps | Miltex | 7-504 | STERRAD |
Wood swabs | MEDLINE | MDS202095 | NA (sterilized package) |
Equipment: *cannulas | |||
Item | |||
Hypodermic needle | EXELINT INTERNATIONAL | 26437 | NA (sterilized package) |
Stainless steel tube | K-TUBE | K30R | NA |
PTFE tube | ZEUS | 216200 | NA |
Equipment: **colored oil | |||
Item | |||
Liquid Candle Dye Concentrate | PremiumCraft | Red/Pink | NA |
Mineral oil | Vi-Jon | S0883 | NA |
STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma |