本プロトコールでは、細胞周期のS/G2期におけるDNA二本鎖末端切除を免疫蛍光ベースの方法を用いて可視化する方法を実証する。
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方法論記事
BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
DNA損傷応答(DDR)の研究は複雑で不可欠な分野であり、がん治療にDDR標的薬を使用することで重要性が増しています。これらの標的はポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PRP)であり、様々な形態のDNA修復を開始する。PARP阻害剤(PARPi)を用いてこれらの酵素を阻害することは、乳癌1型(BRCA1)、BRCA2、またはBRCA2のパートナーおよび局在化器(PALB2)の変異による相同組換え(HR)欠損細胞に治療上の脆弱性を与えることによって合成致死性を達成する。
PARPiで処理された細胞は、DNA二本鎖切断(DSB)を蓄積する。これらの切断はDNA末端切除機構によって処理され、一本鎖(ss)DNAの形成およびその後のDNA修復につながる。BRCA1欠損の状況では、53BP1やDYNLL1などのDNA切除阻害剤の変異を介してDNA切除を再活性化すると、PARPi耐性が引き起こされます。したがって、 セルロ のDNA切除をモニターできることは、DNA修復経路のより明確な理解と、PARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要です。免疫蛍光(IF)ベースの技術により、DNA損傷後のグローバルDNA切除のモニタリングが可能になります。この戦略には、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)によるロングパルスゲノムDNA標識が必要です。DNA損傷およびDNA末端切除に続いて、得られた一本鎖DNAは、天然条件下で抗BrdU抗体によって特異的に検出される。さらに、DNA切除は、細胞周期の様々な段階を区別するために細胞周期マーカーを用いて研究することもできる。S/G2期の細胞はHR内の末端切除の研究を可能にするが、G1細胞は非相同末端結合(NHEJ)の研究に使用することができる。細胞周期弁別に結合されたこのIF法の詳細なプロトコルは、この論文に記載されている。
概要
DNA修復因子の調節は、特にDNA DSB修復不全腫瘍環境において、がん治療のための絶えず進化する方法である。特定の修復因子の阻害は、DNA損傷物質に対して癌細胞を感作するために使用される独創的な戦略の1つである。何十年にもわたる研究の結果、DNA修復遺伝子のさまざまな変異が、治療戦略の選択のためのバイオマーカーとして同定されました1。その結果、DNA修復分野は、幅広い治療を確実にするための医薬品開発のハブとなり、個別化医療の概念を強化しています。
DSBは、NHEJとHR2の2つの主要な経路によって修復されます。NHEJ経路はエラーが発生しやすく、DNAエンドプロセシングをほとんどまたはまったく行わずに2つのDNA末端を迅速にライゲーションし、プロテインキナーゼ(DNA-PKcs)、Ku70/80複合体、53BP1、およびRIF1タンパク質3が関与します。対照的に、HRはBRCA14によって開始された忠実なメカニズムです。HR修復に不可欠なステップはDNA末端切除プロセスであり、これは3'-OH末端を有する一本鎖(ss)DNAにつながる切断末端の分解である。BRCA1は、5'~3'DNA切除に関与する切除体MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1を形成する下流タンパク質のリクルート....
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プロトコル
1. 細胞培養、処理、およびカバースリップの準備
注: すべての細胞プレーティング、トランスフェクション、および処理は、照射を除き、滅菌細胞培養フードの下で行う必要があります。
- 1日目
- 6 ウェルプレートに、各ウェルに 1 つのカバースリップを 1 つの条件だけ配置し、必要な条件だけ配置します。必要に応じて、トランスフェクションまたは薬物処理のための〜150,000個のHeLa細胞をプレート化します。
注: トランスフェクションを行う場合は、めっき時に逆方向トランスフェクションを行うか、めっきの数時間後に順方向トランスフェクションを実行して付着性を保つことをお勧めします。逆トランスフェクションは、細胞が加えられる前にトランスフェクションミックスをカバースリップに加えることによって達成されます。したがって、トランスフェクションは細胞が接着し始める前に開始されます。対照的に、フォワードトランスフェクションは、通常翌日に表面に付着後のトランスフェクションミックスを添加することです。しかし、細胞が接着するのに十分な時間が与えられれば、これを同じ日に行うことができる。 - この方法のために、4つのウェルを使用する:ウェル1:siRNAコントロール(siCTRLと呼ばれる);ウェル2:PARP−1に対するsiRNA(siPARP−1);ウェル3:未処理;ウェル4:照射の1時間前に5 μM BMN673で処理する細胞。
注:....
- 6 ウェルプレートに、各ウェルに 1 つのカバースリップを 1 つの条件だけ配置し、必要な条件だけ配置します。必要に応じて、トランスフェクションまたは薬物処理のための〜150,000個のHeLa細胞をプレート化します。
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結果
このプロトコールでは、ブロモデオキシウリジン(BrdU)ベースのアッセイを使用して、放射線誘発損傷に対するHeLa細胞の切除応答を定量的に測定した。生成されたssDNAトラックは、免疫蛍光染色後に別個の病巣として可視化される(図1A)。次いで、同定された病巣を定量化し、核におけるBrdU染色の総積分強度として表した(図1B、補足図S1、補足図S2、および補足図S3)。病巣数または平均病巣強度を測定することは可能ですが、これは総核強度よりも信頼性が低く、主にBrdU病巣の可変サイズに大きく依存します。
NHEJの結果としての短距離切除とHRの長期切除とを区別するために、抗PCNA抗体を用いて共染色を行い、S期を経る細胞を同定した(図1 および 補足図S4)。PCNAは、DNAポリメラーゼのプロセス性因子とし.......
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ディスカッション
本稿では、IF染色を用いてセルロのDNA切除の変動を測定する方法について説明する。DNA切除への影響を観察するための現在の標準は、RPA染色によるものです。しかし、これはDNA複製の影響を受ける可能性のある間接的な方法です。以前に、BrdU陽性およびBrdU陰性細胞において生じる強度を分類するための別のBrdU組み込みベースのDNA切除IF技術が記載されていた。この方法により、HRを受けていない細胞は、バックグラウンドまたはミトコンドリア染色のために陽性としてカウントされ、高いBrdU強度をもたらす14、15、16が可能になりました。この論文に記載されている方法の主な新規性は、細胞周期のS期およびG2期に対する選択性を可能にし、結果として生じるBrdUシグナルが切除によるものであり、したがって相同性指向性修復によるものであることを保証するPCNA染色の添加である。
このプロトコル.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もありません。
謝辞
マリー=クリスティーヌ・キャロンの卓越した技術的アドバイスに感謝します。この研究は、カナダ衛生研究所J.Y..M(CIHR FDN-388879)からの資金提供によって支えられています。J.-Y..M.は、DNA修復およびがん治療のTier 1カナダ研究委員長を務めています。J.O'SはFRQS博士課程の学生フェローであり、S.Y.MはFRQSポスドクフェローです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Alexa 568ヤギ抗ウサギ | 分子プローブ | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488ヤギ抗マウス | 分子プローブ | A11001 | 1:800 |
| PARP1(F1-23) | 自家製 | 1:2500 | |
| アンチPCNA(SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| アルファチューブリン(DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| ベンチトップX線照射器 | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| ブロモデオキシウリジン (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM 高グルコース | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetalウシ血清 | Gibco | 12483-020 | |
| フィッシャーブランド カバー メガネ: 正方形 22 x 22 | フィッシャーサイエンティフィック | 12 541B | |
| 蛍光顕微鏡 | ライカ | DMI6000B | 63倍液浸対物レンズ |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 インキュベーター CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| ニードル | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold 退色防止封入剤 | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | ダルマコン | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| デオキシコルケートナトリウム | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| ショ糖 | バイオショップカナダ | SUC507.5 | |
| トリスベース | バイオショップカナダ | TRS001.5 | |
| ションX-100 | ミリポアシグマ | T8787-250ML | |
| トゥイーン20 | フィッシャー科学 | BP337500 | |
| ピンセット |
参考文献
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-path....
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再版と許可
