Haemophilus Influenzae'ye Solunum İmmün Yanıtlarının Değerlendirilmesi
Summary
Haemophilus influenzae solunum yollarında inflamasyona neden olur. Bu makalede, bu bakteriye yanıt olarak fagositler ve lenfositler tarafından immün yanıtları tanımlamak için akım sitometrisi ve konfokal mikroskopinin kullanımı üzerinde durulacaktır.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi), çeşitli solunum koşullarında bulunan yaygın bir bakteridir. Bu bakteriye solunum immün / enflamatuar yanıtı değerlendirmek için çeşitli farklı tahliller / teknikler kullanılabilir. Akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi, biyolojik yanıtların ayrıntılı karakterizasyonunu sağlayan floresan tabanlı teknolojilerdir. Hücre duvarı bileşenleri, öldürülmüş / inaktive edilmiş preparatlar ve canlı bakteriler dahil olmak üzere Hi antijeninin farklı formları kullanılabilir. Hi, zenginleştirilmiş ortam gerektiren titiz bir bakteridir, ancak standart laboratuvar ortamlarında yetiştirilmesi genellikle kolaydır. Hi ile stimülasyon için doku örnekleri periferik kan, bronkoskopi veya rezeke akciğerden elde edilebilir (örneğin, akciğer kanseri tedavisi için ameliyat edilen hastalarda). Makrofaj ve nötrofil fonksiyonu, fagositoz, reaktif oksijen türleri ve hücre içi sitokin üretimi dahil olmak üzere ölçülen çeşitli parametrelerle akış sitometrisi kullanılarak kapsamlı bir şekilde değerlendirilebilir. Lenfosit fonksiyonu (örneğin, T hücresi ve NK hücre fonksiyonu), esas olarak hücre içi sitokin üretimi için akış sitometrisi kullanılarak spesifik olarak değerlendirilebilir. Hi enfeksiyonu, hem nötrofiller (NET’ler) hem de makrofajlar (MET’ler) tarafından hücre dışı tuzak üretiminin güçlü bir indükleyicisidir. Konfokal mikroskopi, proteaz aktivitesini değerlendirmek için de kullanılabilecek NET ve MET ekspresyonunu değerlendirmenin tartışmasız en uygun yoludur. Haemophilus influenzae’ye karşı akciğer bağışıklığı, akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirilebilir.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi), çoğu sağlıklı yetişkinin farenksinde bulunan normal bir kommensal bakteridir. Hi, polisakkarit kapsüle sahip olabilir (A-F tipleri, örneğin B veya HiB tipi) veya bir kapsülden yoksun olabilir ve yazılamaz (NTHi)1. Mukozanın bu bakteri ile kolonizasyonu erken çocukluk döneminde başlar ve farklı kolonize edici suşların devrivardır 2. Bu bakteri aynı zamanda hem üst hem de alt solunum yollarının istilasını da yapabilir; bu bağlamda immün yanıtın aktivasyonunu ve inflamasyonu indükleyebilir 3,4. Bu inflamatuar yanıt klinik hastalığa neden olabilir ve sinüzit, otitis media, bronşit, kistik fibroz, pnömoni ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) dahil olmak üzere çeşitli önemli solunum koşullarına katkıda bulunabilir. Bu koşulların çoğu NTHi suşları2’den kaynaklanmaktadır. Bu makalede, Hi’ye karşı solunum immün yanıtlarını değerlendirmek için akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi kullanarak yöntemler açıklanacaktır.
Aşağıda açıklanan yöntemler, Hi’ye enflamatuar yanıtı değerlendirmek için modifiye edilmiş köklü tekniklerden uyarlanmıştır. Hi’nin uygun bir antijenik formunun seçimi bu değerlendirmenin önemli bir parçasıdır. Antijenik preparatlar hücre duvarı bileşenlerinden canlı bakterilere kadar uzanır. Tahlilleri oluşturmak ve standartlaştırmak için, periferik kan örneklerinin kullanımı başlangıçta çok yararlı olabilir.
Akış sitometrisi, hücresel düzeyde bir numuneden çeşitli parametrelerin ve fonksiyonel testlerin ölçülmesini sağlar. Bu teknik, spesifik hücresel yanıtların (örneğin, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi veya hücre içi sitokin üretimi), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) veya ELISspot gibi diğer daha genel yöntemlerle karşılaştırıldığında değerlendirilebilmesi avantajına sahiptir.
Hücre dışı tuzaklar nötrofiller (NET’ler)5,6,7 ve makrofajlar (MET’ler)8 gibi diğer hücreler tarafından eksprese edilir. Özellikle akciğer9’daki enfeksiyonda anahtar inflamatuar yanıt olarak giderek daha fazla tanınmaktadırlar. Konfokal floresan mikroskopi ile değerlendirilebilirler. Bu teknik, NET’lerin / MET’lerin kesin olarak tanımlanmasını sağlar ve ifadelerini diğer hücre ölümü biçimlerinden ayırır6.
Hem akım sitometrisi hem de konfokal mikroskopi floresan bazlı tahlillerdir. Başarıları, biyolojik örneklerin optimal gerilme protokollerine bağlıdır. Bu yöntemlerin öğrenilmesi biraz zaman alır ve uygun denetim uzmanlığı gerektirir. İlgili enstrümanlar da hem satın almak hem de çalıştırmak için pahalıdır. Kullanımları için en uygun ayar, büyük üniversiteleri ve üçüncül sevk hastanelerini içerir.
Bu protokolde kullanılan yöntemler, solunum yolu hastalığında rol oynayan diğer benzer organizmaların (örneğin, Moxarella catarrhalis ve Streptococcus pneumoniae) incelenmesi için aktarılabilir. NTHi ayrıca diğer yaygın solunum bakterileri ile etkileşime girer10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada listelenen yöntemler, Hi’ye inflamatuar akciğer yanıtı hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için birlikte kullanılabilecek floresan bazlı akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi tekniklerini kullanır.
Kullanılacak Hi’nin uygun antijenik formülasyonunun oluşturulması kritik öneme sahiptir ve bu konuda bir mikrobiyologdan spesifik girdi alınması tavsiye edilir. Live Hi daha güçlü bir tepki verirken, öldürülen Hi preparatları ve Hi bileşenleri daha standartlaştır…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Monash Health’teki Klinik İmmünoloji personeline bu çalışmadaki yardımları için teşekkür eder.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
