שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4
Summary
מוצג כאן sgRNA/CAS9 endonuclease ופרוטוקול ריצוף מהדור הבא שניתן להשתמש בו כדי לזהות את המוטציות הקשורות לתיקון שבר גדיל כפול ליד מקדם CD4.
Abstract
שברים של גדיל כפול (DSBs) בדנ”א הם הסוג הציטוטוקסי ביותר של נזק לדנ”א. מאחר ששלל עלבונות יכולים לגרום לנגעים אלה (למשל, מתח שכפול, קרינה מייננת, נזקי UV לא מתוקנים), DSBs מתרחשים ברוב התאים בכל יום. בנוסף למוות תאי, DSBs שלא עודכנו מפחיתים את שלמות הגנום והמוטציות המתקבלות יכולות להניע גידולים סרטניים. סיכונים אלה ושכיחותם של DSBs מניעים חקירות של המנגנונים שבאמצעותם תאים מתקנים נגעים אלה. ניתן לשלב את ריצוף הדור הבא עם אינדוקציה של DSBs על ידי קרינה מייננת כדי לספק כלי רב עוצמה להגדרה מדויקת של המוטציות הקשורות לפגמים בתיקון DSB. עם זאת, גישה זו דורשת ריצוף גנום שלם מאתגר מבחינה חישובית ועלותית כדי לזהות את התיקון של ה-DSBs המתרחשים באופן אקראי הקשורים לקרינה מייננת. אנדונוקליזות חיתוך נדירות, כגון I-Sce1, מספקות את היכולת ליצור DSB יחיד, אך יש להכניס את אתרי הזיהוי שלהן לגנום המעניין. כתוצאה מכך, אתר התיקון הוא מלאכותי מטבעו. ההתקדמות האחרונה מאפשרת ל-RNA מנחה (sgRNA) לכוון אנדונוקלאז Cas9 לכל מוקד גנום שמעניין אותו. ניתן ליישם זאת במחקר של תיקון DSB שהופך את ריצוף הדור הבא לחסכוני יותר בכך שהוא מאפשר להתמקד בדנ”א האגף ל-DSB המושרה על ידי Cas9. מטרת כתב היד היא להדגים את ההיתכנות של גישה זו על ידי הצגת פרוטוקול שיכול להגדיר מוטציות הנובעות מתיקון של DSB במעלה הזרם של הגן CD4. ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי לקבוע שינויים בפוטנציאל המוטאגני של DSB הקשורים לגורמים אקסוגניים, כגון מעכבי תיקון, ביטוי חלבונים ויראליים, מוטציות וחשיפות סביבתיות עם דרישות חישוב מוגבלות יחסית. לאחר ריצוף הגנום של אורגניזם, ניתן להשתמש בשיטה זו באופן תיאורטי בכל לוקוס גנומי ובכל מודל תרבית תאים של אותו אורגניזם שניתן לבצע טרנספקטציה. התאמות דומות של הגישה יכולות לאפשר השוואות של נאמנות תיקון בין מוקדים שונים באותו רקע גנטי.
Introduction
שמירה על יציבות גנומית היא קריטית עבור כל האורגניזמים החיים. שכפול דנ”א מדויק ותגובת נזק חזקה לדנ”א (DDR) נחוצים כדי להפיץ בנאמנות את החומר הגנטי 1,2. נזקי דנ”א מתרחשים באופן קבוע ברוב התאים 2,3. כאשר חשים נזקים אלה, התקדמות מחזור התאים נעצרת, ומנגנוני תיקון הדנ”א מופעלים. שברים של גדילים כפולים בדנ”א או ב-DSBs הם הסוג הרעיל והמוטגני ביותר של נזק לדנ”א 3,4.
בעוד שכמה מסלולי איתות DDR יכולים לתקן נגעים אלה, מסלולי תיקון DSB שנחקרו ביסודיות הרבה ביותר הם רקומבינציה הומולוגית (HR) והצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ). HR הוא מסלול נטול שגיאות ברובו, המתקן DSB באמצעות כרומטיד אחות כתבנית הומולוגית. זה נוטה לקרות בשלב S ובשלב G2 של מחזור התא 5,6,7. NHEJ מועד יותר לשגיאות, אבל זה יכול לקרות לאורך כל מחזור התא 8,9. מבחני כתבים שונים פותחו כדי למדוד את היעילות של מנגנוני תיקון ספציפיים 10,11,12. מבחנים אלה נוטים להסתמך על ציטומטריית זרימה למדידת תפוקה גבוהה של פעילות מסלול תיקון DSB באמצעות GFP או mCherry כקריאה11,13. למרות שהם יעילים מאוד, הם מסתמכים על תיקון קנוני המתרחש ב- DSB שהוכנס באופן מלאכותי.
ישנן מגוון שיטות אחרות המשמשות לחקר תיקון DSB. רבים מהם מסתמכים על מיקרוסקופיה אימונו-פלואורסצנטית (IF) 1,14. אם מיקרוסקופיה מזהה מוקדים גרעיניים בדידים המייצגים את מתחמי התיקון לאחר ש-DSBs מושרים על ידי חשיפה לכימיקלים גנוטוקסיים או קרינה מייננת15,16. מעקב אחר היווצרותם ופתרונן של מוקדים אלה מספק אינדיקציה לתחילת התיקון ולהשלמתו, בהתאמה14,17. עם זאת, שיטות אלה של אינדוקציה DSB (כלומר, כימיקלים או קרינה מייננת) אינן גורמות ל-DSBs במקומות מוגדרים בגנום. זה גם בלתי אפשרי מבחינה פונקציונלית להשתמש בהם כדי לגרום באופן עקבי רק למספר קטן (למשל, 2-4) של DSBs. כתוצאה מכך, השיטות הנפוצות ביותר של גרימת DSBs לגרום לשפע של נגעים המופצים באופן אקראי ברחבי הגנום18. ניתן להציג מספר קטן של DSBs על ידי הכנסת אתר הזיהוי לאנדונוקלאז חותך נדיר והבעת האנדונוקלאז הרלוונטי, כגון I-Sce119. למרבה הצער, האינטגרציה הנדרשת של אתר מטרה מונעת בדיקה של DSB במוקדים גנומיים אנדוגניים.
כתב יד זה מתאר שיטה לאיתור מוטציות הקשורות לתיקון של DSB שנוצר בלוקוס המוגדר על ידי המשתמש. אנו מספקים דוגמה מייצגת לגישה המיושמת להערכת יכולתו של חלבון נגיפי להגדיל את מספר המוטציות הקשורות ל-DSB. באופן ספציפי, כתב יד זה מתאר את השימוש ברנ”א מנחה יחיד (sgRNA) כדי לכוון אנדונוקלאז CAS9 כדי לגרום ל-DSB במסגרת קריאה פתוחה CD4 אנושית בעורלה אנושית קרטינוציטים המבטאים שליטה וקטורית (HFK LXSN) ו-HFK המבטאת את חלבון E6 של נגיף הפפילומה האנושי מסוג 8 (HFK 8E6). ריצוף ממוקד של הדור הבא (NGS) של האזור המקיף את השבר מאפשר להגדיר בקפדנות מוטציות הקשורות לתיקון הנגע. נתונים אלה מראים כי החלבון הנגיפי גורם לעלייה של כ-20 פעמים במוטציות במהלך תיקון DSB. הוא גם מספק אפיון בלתי משוחד של ההשלכות המוטגניות של DSBs במוקד יחיד ללא צורך בריצוף גנום שלם. באופן עקרוני, ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות כדי להשוות את הסיכון היחסי למוטציות בין מוקדי הגנום או קווי התאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בנוסף לעומק המידע המסופק, ישנם מספר יתרונות לשיטה זו. ראשית, תיקון DSB, בתיאוריה, ניתן להעריך בכל מוקד גנומי מבלי לשנות את הגנום של התא המעניין. שנית, הגישה לניתוח NGS של תיקון גדלה על ידי העלות המופחתת והמאמץ החישובי הניתנים על ידי ביצוע וניתוח של DSB יחיד המיועד לאזור מוגדר. לבסוף, כאשר הגנומים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שדווח בכתב יד זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים של המכונים הלאומיים לבריאות (P20GM130448) (NAW ו- RP); המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות (NCI R15 CA242057 01A1); מרכז ג’ונסון לחקר הסרטן באוניברסיטת קנזס סטייט; ומשרד ההגנה של ארה”ב (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). אנו מעריכים את KSU-CVM Confocal Core ואת ג’ואל סנמן על המיקרוסקופיה האימונופלואורסצנטית שלנו. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של הכותבים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של סוכנויות מימון אלה.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -. X. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
