आनुवंशिक रूप से इंजीनियर एनोफिलीन मच्छरों के छोटे पिंजरे प्रयोगशाला परीक्षण

Summary

यहां रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल प्रयोगशाला-निहित छोटे पिंजरे के परीक्षणों में वेक्टर नियंत्रण के लिए नियत आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मच्छरों के प्रदर्शन का आकलन करने के तीन वैकल्पिक तरीकों को दर्शाते हैं। प्रत्येक प्रोटोकॉल को विशिष्ट संशोधन मच्छर तनाव भालू (जीन ड्राइव या गैर-जीन ड्राइव) और मापा मापदंडों के प्रकारों के अनुरूप है।

Abstract

आनुवांशिक रूप से संशोधित वैक्टरों का उपयोग करके मच्छर-जनित रोगजनकों के नियंत्रण को पारंपरिक नियंत्रण रणनीतियों के पूरक के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। CRISPR-आधारित होमिंग जीन ड्राइव सिस्टम ने ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियों को वैज्ञानिक समुदाय के भीतर अधिक सुलभ बना दिया है। ट्रांसजेनिक मच्छर के प्रदर्शन का मूल्यांकन और छोटे प्रयोगशाला पिंजरे के परीक्षणों में जंगली-प्रकार के समकक्षों के साथ तुलना रोग की रोकथाम के लिए रणनीतियों को परिष्कृत करने के लिए बाद के क्षेत्र पिंजरे के प्रयोगों और प्रयोगात्मक आकलनों के डिजाइन के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान करती है। यहां, हम मलेरिया के एनोफिलिन मच्छर वैक्टर में फैलने वाले ट्रांसजीन का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोगशाला सेटिंग्स में उपयोग किए जाने वाले तीन अलग-अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इनमें निष्क्रिय रिलीज (कोई जीन-ड्राइव सिस्टम नहीं), और जीन-ड्राइव ओवरलैपिंग और गैर-ओवरलैपिंग पीढ़ी के परीक्षण शामिल हैं। तीन परीक्षण कई मापदंडों में भिन्न होते हैं और उन्हें वांछित प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, छोटे पिंजरों में कीटीय अध्ययन प्रयोगशाला से खुले क्षेत्र रिलीज के लिए इंजीनियर कीड़ों के प्रगतिशील संक्रमण का हिस्सा हैं। इसलिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल अनुभवजन्य मूल्यों को प्रदान करने के लिए अमूल्य उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो अंततः मलेरिया उन्मूलन के लिए नई प्रौद्योगिकियों के क्षेत्र कार्यान्वयन में सहायता करेंगे।

Introduction

आनुवांशिक रूप से इंजीनियर मच्छरों पर आधारित कार्यनीतियों को वेक्टर जनित रोगजनकों के संचरण को नियंत्रित करने के लिए अपनाया जा रहा है जैसे ^{कि मलेरिया का} कारण बनता है। इनमें प्रौद्योगिकियां शामिल हैं 1) एनोफिलीज़ मच्छरों (जनसंख्या दमन) की संख्या और घनत्व को कम करने के उद्देश्य से, या 2) का उद्देश्य मानव रोग (जनसंख्या संशोधन, प्रतिस्थापन, या परिवर्तन) के लिए जिम्मेदार परजीवी को संचारित करने के लिए वैक्टर की क्षमता को कम करना है, जिसमें वैक्टर के उपभेदों को प्रभावक जीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जाता है जो रोगज़नक़ संचरण को रोकते हैं। इन आनुवांशिक दृष्टिकोणों को CRISPR / Cas9-आधारित जीन ड्राइव के आगमन से बल मिला है, जिसमें पेलोड लक्षणों के प्रभावी प्रसार के परजीवी-संचारण मच्छरों के साथ-साथ पिंजरे में बंद आबादी में एंटी-परजीवी प्रभावक अणुओं के प्रमाण-की-अवधारणा है।

छोटे प्रयोगशाला पिंजरे के परीक्षण क्षेत्र अनुप्रयोगों की ओर उनके आगे के विकास के लिए एक चरणबद्ध दृष्टिकोण के हिस्से के रूप में ट्रांसजेनिक उपभेदों की विशेषता का मूल्यांकन करने के लिए एक पहला कदम का प्रतिनिधित्व करते ^हैं2। विशिष्ट परिणाम विचारों में एक प्रतिस्पर्धी वातावरण में पेश किए गए डीएनए की वंशानुगतता, फेनोटाइप की पेनेट्रेंस और अभिव्यक्ति, और स्थिरता शामिल हैं। प्रासंगिक प्रयोगात्मक डिजाइन सुविधाओं में पिंजरों का आकार, मच्छर घनत्व, प्रतिकृतियों की संख्या, ओवरलैपिंग या गैर-अतिव्यापी पीढ़ियों, आयु-संरचित लक्ष्य आबादी, इंजीनियर उपभेदों के एकल या कई रिलीज, केवल पुरुष-केवल, केवल महिला-या मिश्रित-सेक्स रिलीज, रिलीज अनुपात, रक्त भोजन स्रोत (कृत्रिम या जीवित पशु), और स्क्रीनिंग प्रक्रियाएं शामिल हैं।

हम यहां उन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो कि अनचाहेतुक रिलीज (कोई जीन-ड्राइव सिस्टम नहीं) के लिए एनोफेलिन मच्छरों के उपभेदों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं और जो कैस 9 एंडोन्यूक्लिएज द्वारा मध्यस्थता वाले स्वायत्त जीन-ड्राइव सिस्टम को ले जाते हैं और आरएनए (जीआरएनए) का मार्गदर्शन करते हैं। इन प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग Pham et al में दिखाई देते हैं। (2019) ², Carballar-Lejarazú et al. (2020) ³, और एडॉल्फी एट अल। (2020) ^४ ।

Inundative रिलीज परीक्षण एक जंगली आबादी में ट्रांसजेनिक मच्छरों की एक बड़ी संख्या के कई रिलीज के बाद मेंडेलियन विरासत के तहत एक डिजाइन ट्रांसजीन की प्रसार दर का मूल्यांकन करते हैं। एक ड्राइव सिस्टम के लिए ट्रांसजीन के लगाव के बिना, निष्क्रिय रिलीज परीक्षणों से डेटा एक स्थिर आबादी में ब्याज के ट्रांसजीन की फिटनेस और गतिशील के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

जब मच्छरों की आबादी में एक स्वायत्त जीन-ड्राइव प्रणाली होती है, तो छोटे पिंजरे के परीक्षणों को ट्रांसजेनिक पुरुषों के एकल परिचय के बाद प्रमुख मार्कर वृद्धि की दर का निर्धारण करके वांछित ट्रांसजीन के प्रसार की गतिशीलता का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। स्वायत्त जीन-ड्राइव तत्व Cas9 न्यूक्लिएज, gRNA और प्रमुख मार्कर को एन्कोडिंग करने वाले जीनों को इस तरह के फैशन में जोड़ते हैं जो बाद की पीढ़ियों में सक्रिय होने के लिए इस तरह से जुड़े होते हैं।

‘ओवरलैपिंग’ पीढ़ियां एक उम्र-संरचित निरंतर आबादी बनाने के लिए एक ही पिंजरे में कई पीढ़ियों की एक साथ उपस्थिति को संदर्भित करती हैं, जबकि ‘गैर-ओवरलैपिंग’ प्रत्येक लगातार पिंजरे में बंद आबादी में एकल असतत पीढ़ियों को संदर्भित करता ^है2। जीन-ड्राइव पिंजरे के प्रयोगों को समाप्त किया जा सकता है एक बार ड्राइव (रूपांतरण) दर की प्रारंभिक गतिशीलता निर्धारित की जा सकती है (निर्माण के आधार पर 8-10 पीढ़ियां), और जब वे मच्छर आबादी के भीतर ट्रांसजीन की अल्पकालिक स्थिरता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, तो वे यह प्रकट नहीं कर सकते हैं कि जब और यदि प्रमुख मार्कर आवृत्तियां पूर्ण परिचय तक पहुंचती हैं या उनके करीब होती हैं (जीन-ड्राइव सिस्टम की कम से कम एक प्रति लिपि ले जाने वाला प्रत्येक मच्छर)।

Protocol

पशु नैतिकता कथनयह अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुसार सख्ती से किया गया था। प्रोटोकॉल को कैलिफ़ोर्निया विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था (पशु कल्याण आश्वासन संख्या A3416.01)। 1. गैर जीन ड्राइव मच्छरों पर Inundative रिलीज परीक्षण (चित्रा 1) पिंजरे सेटअप और रखरखाव तीन लगातार हफ्तों में प्रत्येक पिंजरे में 60 सेकंड-इंस्टार वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) लार्वा जोड़कर 0.216 एम 3 पिंजरों के तीन सेट सेट सेट करें।नोट: प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा दूसरे-इंस्टार लार्वा के लिंग को निर्धारित करना संभव नहीं है, इसलिए प्रत्येक पिंजरे में जोड़े गए नमूनों में नर और मादा दोनों शामिल होंगे। हर हफ्ते, रक्त के मांस के स्रोत (चित्रा 2 ए) के रूप में एनेस्थेटिक चूहों के साथ प्रत्येक पिंजरे में वयस्क मादाओं को प्रदान करें और रक्त के मांस के 3 दिन बाद एक ओवीपोज़िशन कंटेनर प्रदान करें।नोट: जबकि एक वैकल्पिक कृत्रिम खिला उपकरण का उपयोग किया जा सकता है, रक्त के लिए लाइव एनेस्थेटिक चूहों को प्रदान करने के परिणामस्वरूप इन बड़े (0.216 एम 3) पिंजरे के प्रारूपों में बेहतर मच्छर खिला प्रदर्शन होता है। इसके लिए एक अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल और प्रासंगिक (जैसे, संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति, आईएसीयूसी) चूहों का उपयोग करने के लिए अनुमोदन की आवश्यकता होती है।नोट: व्यक्तिगत चूहों को 4 मिलीग्राम / माउस केटामाइन एचसीएल और 0.4 मिलीग्राम / माउस xylazine के मिश्रण के साथ एनेस्थेटिक किया जाता है। जानवरों को इस मिश्रण के 0.1 – 0.5 मिलीलीटर के बीच इंजेक्ट किया जाता है। प्रत्येक पिंजरे से अंडे साप्ताहिक हैच करें और यादृच्छिक रूप से 60 सेकंड-इनस्टार (एल 2) लार्वा का चयन करें ताकि मृत्यु दर (सप्ताह 4-8) को ऑफसेट करने के लिए अपने संबंधित पिंजरों में वापस आ सकें।नोट: चरण 1.1.1 से 1.1.3 पिंजरों में एक स्थिर और वितरित आयु-संरचित आबादी स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं – जिसे ‘प्रारंभिक चरण’ के रूप में संदर्भित किया जाता है। सप्ताह 9 में, वांछित पुरुष रिलीज अनुपात की रिहाई के लिए बेतरतीब ढंग से तीन प्रतियों में चरण 1.1.1 में इकट्ठे हुए पिंजरों को असाइन करें। प्रयोग के दौरान स्थिरता का आकलन करने के लिए नियंत्रण के रूप में तीन गुना पिंजरों के एक सेट को नामित करें। प्रत्येक वांछित रिलीज अनुपात के लिए तीन प्रतियों के एक सेट को नामित करें (उदाहरण के लिए, 1: 1 या 1: 0.1 ट्रांसजेनिक: डब्ल्यूटी पुरुष)।नोट: इस बिंदु पर ‘प्रयोगात्मक चरण’ के रूप में संदर्भित किया जाता है। प्रतिकृति और रिलीज़ अनुपात साप्ताहिक नियंत्रण पिंजरों में 60 WT pupae (30 पुरुषों और 30 मादाओं) जोड़ें। 1: 1 अनुपात बनाए रखने के लिए, प्रत्येक संबंधित पिंजरे में 60 (30 पुरुष और 30 महिला) डब्ल्यूटी प्यूपे के साथ साप्ताहिक 30 ट्रांसजेनिक पुरुष प्यूपे जोड़ें। 1: 0.1 अनुपात को बनाए रखने के लिए, प्रत्येक संबंधित पिंजरे में 60 (30 पुरुष और 30 महिला) डब्ल्यूटी प्यूपे के साथ साप्ताहिक 300 ट्रांसजेनिक पुरुष प्यूपे जोड़ें।नोट: पिंजरों में जंगली मच्छरों के निरंतर अतिरिक्त पिंजरे के घनत्व को बनाए रखता है, जो उम्र से संबंधित वयस्क मृत्यु दर के कारण साप्ताहिक रूप से कम होने की उम्मीद है। फेनोटाइप्स की स्क्रीनिंग यादृच्छिक रूप से प्रत्येक पिंजरे से कुल 300 लार्वा का चयन करें। प्रतिदीप्ति फिल्टर से सुसज्जित एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के उपयोग के साथ, लार्वा और प्यूपल चरणों में फ्लोरोसेंट प्रमुख मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीन और परिणामी वयस्कों के लिंग को स्कोर करें (चित्रा 3)।नोट: फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग मच्छरों में एकीकृत ट्रांसजीन निर्माण में शामिल प्रमुख मार्कर पर निर्भर करेगी (उदाहरण के लिए, डिस्कोसोमा एसपी रेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन [DsRed], सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन [CFP], ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन [GFP]), और प्रमोटर पर अपनी अभिव्यक्ति चला रहा है (मच्छर ट्रांसजेनेसिस में सबसे अधिक उपयोग किया जाता है आंखों और तंत्रिका कॉर्ड में 3xP3 प्रमोटर ड्राइविंग अभिव्यक्ति है)। प्रयोगात्मक डिजाइन में परिभाषित परिणाम मापदंडों द्वारा आवश्यक के रूप में कई पीढ़ियों के लिए इस प्रोटोकॉल का पालन करें।नोट: परीक्षण आमतौर पर समाप्त हो जाता है जब सभी मच्छरों में ट्रांसजीन की कम से कम एक प्रति होती है (प्रमुख फ्लोरोसेंट मार्कर की उपस्थिति द्वारा निर्धारित) या पिंजरे में ट्रांसजेनिक-टू-डब्ल्यूटी मच्छरों का अनुपात स्थिर हो जाता है और कुछ (3-5) पीढ़ियों के बाद बहुत उतार-चढ़ाव नहीं होता है। 2. जीन ड्राइव मच्छरों के अतिव्यापी पीढ़ी परीक्षण (चित्रा 4) नोट: जीन-ड्राइव सिस्टम ले जाने वाले मच्छरों को लिखित और समीक्षा प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है और उन्हें संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) या समकक्ष, और अन्य जहां आवश्यक हो, द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए। मच्छर की रोकथाम (एसीएल 2 + स्तर) को अनुशंसित प्रक्रियाओं का पालन करना चाहिए5,6,7। विशेष रूप से, जीन ड्राइव प्रयोगों को दो कठोर कारावास रणनीतियों को नियोजित करना चाहिए। पहला आमतौर पर जीवों और पर्यावरण के बीच भौतिक बाधाएं (बैरियर रणनीति) होती हैं। इसके लिए यह सुनिश्चित करने के लिए एक सुरक्षित कीट और मानक संचालन प्रक्रियाओं (निगरानी सहित) की आवश्यकता होती है कि मच्छर बच नहीं सकते हैं। दूसरी कारावास रणनीति आणविक, पारिस्थितिक या प्रजनन 5 हो सकती है। पिंजरे सेटअप प्रत्येक वांछित ट्रांसजेनिक: डब्ल्यूटी पुरुष रिलीज अनुपात के लिए तीन बार 0.216 m3 पिंजरों के दो सेट सेट सेट करें। 1: 1 के पुरुष रिलीज अनुपात को प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक प्रतिकृति पिंजरे में प्यूपा चरण में 120 ट्रांसजेनिक पुरुषों, 120 डब्ल्यूटी पुरुषों और 120 डब्ल्यूटी महिलाओं को जोड़ें। 1: 10 के रिलीज अनुपात को प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक प्रतिकृति पिंजरे में प्यूपा चरण में 12 ट्रांसजेनिक पुरुषों, 120 डब्ल्यूटी पुरुषों और 120 डब्ल्यूटी महिलाओं को जोड़ें।नोट: विभिन्न रिलीज अनुपातों का परीक्षण किया जा सकता है (1: 1, 1: 3, 1: 10, आदि) और प्रयोगों को शुरू करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मच्छरों की संख्या तदनुसार भिन्न होती है। हालांकि, डेटा के सांख्यिकीय मूल्यांकन पर कम संख्या के प्रभावों पर विचार करना महत्वपूर्ण है। जनसंख्या रखरखाव और स्क्रीनिंग anesthetized चूहों (चित्रा 2A) का उपयोग कर एक रक्त भोजन के साथ प्रत्येक पिंजरे में 4-7 दिन पुरानी मादाएं प्रदान करें। रक्त भोजन के तीन दिन बाद, प्रत्येक पिंजरे में एक ओवीपोज़िशन कंटेनर डालें। लार्वा ट्रे में अंडे हैच करें, प्रत्येक पिंजरे से यादृच्छिक रूप से ~ 240 पहले इंस्टार (एल 1) लार्वा का चयन करें, उन्हें वयस्कता में पीछे करें, और उन्हें अपने संबंधित पिंजरों में वापस कर दें। नए उभरे वयस्कों के लिए हर 3-4 दिनों में अतिरिक्त (2-3) रक्त भोजन प्रदान करें जैसा कि चरण 2.2.1 में वर्णित है।नोट: बाद की पीढ़ियों में से किसी के दौरान कोई अतिरिक्त ट्रांसजेनिक पुरुष नहीं जोड़े जाते हैं। यादृच्छिक रूप से प्रत्येक पिंजरे से कुल 300 लार्वा का चयन करें और उन्हें एक प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लार्वा और प्यूपल चरणों में प्रमुख मार्कर फेनोटाइप की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करें और सेक्स के लिए उभरते वयस्कों को स्कोर करें (चित्रा 3)।नोट: पहले की तरह, फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग जीन-ड्राइव सिस्टम में शामिल प्रमुख मार्कर और प्रमोटर पर निर्भर करेगी और ट्रांसजेनिक मच्छरों (जैसे, DsRed, CFP या GFP) में एकीकृत होगी। यदि लक्षित जीनों के होमोजीगस या विषमयुग्मक व्यवधानों के परिणामस्वरूप एक दृश्यमान फेनोटाइप (उदाहरण के लिए, आंखों के रंजकता से संबंधित जीन) होता है, तो इस विशेषता की स्क्रीनिंग इस बात पर निर्भर करेगी कि परिवर्तित फेनोटाइप की कल्पना करना किस चरण में सबसे आसान है। प्रयोगात्मक डिजाइन में परिभाषित परिणाम मापदंडों द्वारा आवश्यक के रूप में कई पीढ़ियों के लिए इस प्रोटोकॉल का पालन करें।नोट: प्रत्येक पीढ़ी (रक्त भोजन द्वारा सीमांकित) ~ तीन सप्ताह लगते हैं। परीक्षण आमतौर पर समाप्त हो जाता है जब सभी मच्छरों को जीन-ड्राइव निर्माण के लिए समयुग्मज माना जाता है या आबादी जीन-ड्राइव निर्माण की कम से कम एक प्रति लिपि ले जाने वाले मच्छरों के अधिकतम प्रतिशत पर स्थिर हो जाती है। 3. गैर अतिव्यापी जीन ड्राइव मच्छरों के पीढ़ी परीक्षण (चित्रा 5). पिंजरे सेटअप डब्ल्यूटी पुरुषों के लिए ट्रांसजेनिक्स के प्रत्येक विशिष्ट रिलीज अनुपात के लिए तीन प्रतियों की 0.005 मीटर 3 पिंजरे की आबादी सेट करें (उदाहरण के लिए, 1: 1, 1: 3, 1: 10 रिलीज अनुपात के साथ प्रत्येक स्थापित तिगुना पिंजरों के तीन सेट)। पुरुषों और महिलाओं की एक समान कुल संख्या के साथ सभी पिंजरों की स्थापना करें।नोट:: अनुपूरक फ़ाइल 0.005 m3 कॉलोनी पिंजरे के निर्माण का प्रदर्शन एक वीडियो है। 1: 1 पुरुष रिलीज अनुपात प्राप्त करने के लिए तीन प्रतिकृति पिंजरों में से प्रत्येक में 50 ट्रांसजेनिक पुरुषों, 50 डब्ल्यूटी पुरुषों और 100 डब्ल्यूटी महिलाओं को जोड़ें। 1: 3 पुरुष रिलीज अनुपात प्राप्त करने के लिए तीन प्रतिकृति पिंजरों में से प्रत्येक में 25 ट्रांसजेनिक पुरुषों, 75 डब्ल्यूटी पुरुषों और 100 डब्ल्यूटी महिलाओं को जोड़ें। 1: 10 पुरुष रिलीज अनुपात प्राप्त करने के लिए तीन प्रतिकृति पिंजरों में से प्रत्येक में 9 ट्रांसजेनिक पुरुषों, 90 डब्ल्यूटी पुरुषों और 100 डब्ल्यूटी महिलाओं को जोड़ें।नोट: विभिन्न रिलीज अनुपात का परीक्षण किया जा सकता है और प्रयोगों को शुरू करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मच्छरों की संख्या तदनुसार भिन्न हो सकती है। हालांकि, सांख्यिकीय विश्लेषण पर मच्छरों की कम संख्या के प्रभाव पर विचार करना महत्वपूर्ण है। ये एकल रिलीज हैं; कोई अतिरिक्त ट्रांसजेनिक पुरुषों को किसी भी बाद की पीढ़ी में नहीं जोड़ा जाता है। जनसंख्या रखरखाव और स्क्रीनिंग प्रत्येक पिंजरे में 4-7 दिनों की पुरानी मादाओं को लगातार दो दिनों में एक कृत्रिम भोजन उपकरण (चित्रा 2 बी) का उपयोग करके रक्त भोजन प्रदान करें।नोट: महिलाओं के लिए नियमित रक्त भोजन में रक्त का एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोत (उदाहरण के लिए, बछड़े का रक्त) होता है जो एक खिला उपकरण से प्रदान किया जाता है। लाइव anesthetized चूहों का उपयोग केवल बेहतर खिला प्रदर्शन के लिए बड़े (0.216 m3) पिंजरे के प्रारूपों में bloodmeals प्रदान करने के लिए किया जाता है। दूसरे bloodmeal के 3 दिन बाद एक oviposition कंटेनर जोड़ें। तीन दिनों के बाद, oviposition कंटेनरों को हटा दें।नोट: इस चरण में, 5-10 महिलाओं को प्रत्येक पिंजरे से यादृच्छिक रूप से चुना जा सकता है और यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त फिटनेस मापदंडों, जैसे प्रजनन क्षमता और प्रजनन क्षमता का आकलन करने के लिए शीशियों में व्यक्तिगत रूप से रखा जा सकता है। सेक्स द्वारा स्कोर सभी वयस्कों (मृत और जीवित) पिंजरे में शेष हैं और आणविक विश्लेषण के लिए उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करते हैं। अंडे हैच और बेतरतीब ढंग से 1: 1 और 1: 3 अनुपात पिंजरों से 200 एल 1 लार्वा का चयन करें ताकि अगली पीढ़ी के लिए नए पिंजरों को पॉप्युलेट किया जा सके।नोट: 1: 10 अनुपात पिंजरों में ट्रांसजेनिक व्यक्ति को शुरू करने की कम आवृत्ति के कारण, यादृच्छिक नमूनाकरण आबादी को आगे बढ़ाने के लिए अगली पीढ़ी में ट्रांसजेनिक संतानों के अत्यधिक नुकसान का कारण बन सकता है। 1: 10 पिंजरों और ट्रांसजेनिक मच्छरों की पर्याप्त संख्या के लिए एक सटीक नमूना सुनिश्चित करने के लिए, प्रमुख मार्कर के लिए सभी लार्वा को स्क्रीन करें और नए पिंजरों को पॉप्युलेट करने के लिए मनाया ट्रांसजीन आवृत्ति को प्रतिबिंबित करने वाले 200 लार्वा का चयन करें।नोट: 1: 10 पिंजरों को 1: 1 और 1: 3 पिंजरों के समान रूप से बनाए रखा जा सकता है जब वे ≥80% की ट्रांसजीन आवृत्ति तक पहुंचते हैं। एक गहन विश्लेषण के लिए यादृच्छिक रूप से प्रत्येक पिंजरे से 500 लार्वा का चयन करें। लार्वा और प्यूपल चरणों में अपेक्षित मार्कर फेनोटाइप के लिए एक प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत स्क्रीन और वयस्कों के स्कोर सेक्स (चित्रा 3)।नोट: ‘असाधारण’ फेनोटाइप्स को प्रतिरोधी एलील गठन की निगरानी के लिए आणविक रूप से आगे पार करने और विश्लेषण करने के लिए चुना जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के रूप में कई पीढ़ियों के लिए के रूप में प्रयोगात्मक डिजाइन में परिभाषित परिणाम मापदंडों द्वारा आवश्यक के रूप में पालन किया जा सकता है.नोट: प्रत्येक पीढ़ी bloodmeal द्वारा सीमांकित है और ~ तीन सप्ताह लगते हैं। परीक्षण आमतौर पर समाप्त हो जाता है जब सभी मच्छरों को जीन-ड्राइव निर्माण के लिए समयुग्मज माना जाता है या आबादी ट्रांसजेनिक मच्छरों के अधिकतम प्रसार पर स्थिर हो जाती है। और पहले की तरह, फेनोटाइप्स के लिए स्क्रीनिंग ट्रांसजेनिक मच्छरों (उदाहरण के लिए, DsRed, CFP, GFP) या लक्षित जीनों में एकीकृत प्रमुख मार्करों और प्रमोटर पर निर्भर करेगी यदि वे एक दृश्यमान फेनोटाइप (उदाहरण के लिए, आंखों के रंजकता से संबंधित जीन) पेश करते हैं।

Representative Results

गैर-जीन ड्राइव या स्वायत्त जीन-ड्राइव संशोधनों को सहन करने के लिए उत्पन्न ट्रांसजेनिक एनोफेलिन मच्छरों को पिंजरे के परीक्षणों के लिए स्थापित किया जाता है जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है। यहां दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम फाम एट अल द्वारा किए गए पिंजरे के परीक्षणों में से प्रत्येक के सर्वोत्तम प्रदर्शन वाले प्रतिकृतियों की फेनोटाइप गतिशीलता को दर्शाते हैं। (2019) एनोफिलीज़ स्टीफेंसी मच्छरों के लिए 2। तीन परीक्षण (1 – 3, क्रमशः: निष्क्रिय गैर-जीन ड्राइव, ओवरलैपिंग जीन-ड्राइव और गैर-ओवरलैपिंग जीन-ड्राइव) विभिन्न मापदंडों में भिन्न होते हैं, जैसे कि पिंजरे का आकार (0.216 m3 बनाम 0.005 m3), चाहे लक्ष्य आबादी उम्र-संरचित, रक्त भोजन का स्रोत (चूहों या कृत्रिम फीडर) और रिलीज अनुपात हो या नहीं। प्रतिनिधित्व के साधन के रूप में, चित्रा 6 सात पीढ़ियों के पाठ्यक्रम पर उपयोग किए गए सभी तीन प्रोटोकॉल के लिए एक ही रिलीज अनुपात (1: 1) से चुने गए देखे गए डेटा को प्रदर्शित करता है। 1: 1 गैर-ड्राइव रिलीज 6-7 पीढ़ियों के भीतर >80% ट्रांसजीन परिचय तक पहुंचता है। जीन-ड्राइव ट्रांसजेनिक पिंजरे के परीक्षणों के लिए, गैर-ओवरलैपिंग और ओवरलैपिंग प्रोटोकॉल दोनों में 1: 1 रिलीज 3-4 पीढ़ियों के भीतर इस स्तर तक पहुंचते हैं, इस प्रकार, इस उम्मीद को मान्य करते हुए कि जीन ड्राइव सिस्टम की एक एकल रिलीज ट्रांसजीन परिचय के लिए गैर-ड्राइव निष्क्रिय रिलीज की तुलना में अधिक कुशल हो सकती है। तेजी से प्रक्षेपवक्र भी trendlines की ढलान से पुष्टि की जा सकती है. दोनों जीन-ड्राइव प्रोटोकॉल, अलग-अलग सेट अप के बावजूद, समान कोण और ढलान रुझान प्रस्तुत करते हैं। अवलोकन के अंत में, गैर-ड्राइव पिंजरे ट्रांसजीन को सहन करने वाले व्यक्तियों के ~ 80% प्राप्त करते हैं, जबकि जीन-ड्राइव व्यक्तियों के साथ पिंजरे पूर्ण (या पूर्ण) परिचय तक पहुंचते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके व्यक्तिगत प्रयोग परिणामों पर पूरा डेटा और प्रसंस्करण विवरण फाम एट अल के आंकड़े 1-3 में पाया जा सकता है। (2019) 2, आंकड़े 2-3 Carballar-Lejarazú et al के. (2020) 3 और चित्रा 3 Adolfi एट अल के. (2020) ४ । चित्र 1. गैर ड्राइव inundative रिलीज परीक्षण योजनाबद्ध.  नौ 0.216 m3 पिंजरों को 60 जंगली-प्रकार के दूसरे-इंस्टार (मिश्रित-लिंग) लार्वा के साथ स्थापित किया जाता है, जिन्हें प्रत्येक में जोड़ा जाता है। सप्ताह 3 की शुरुआत में, मादाओं को साप्ताहिक रूप से एक रक्तगीत प्रदान किया जाता है और अंडे एकत्र किए जाते हैं और हैच किए जाते हैं। सप्ताह 8 तक, 60 लार्वा को बेतरतीब ढंग से चुना जाता है और पिंजरों (प्रारंभिक चरण) में एक आयु-संरचित आबादी बनाने के लिए साप्ताहिक रूप से अपने संबंधित पिंजरों में वापस कर दिया जाता है। सप्ताह 9 की शुरुआत में, नौ पिंजरों को बेतरतीब ढंग से उनके ट्रांसजेनिक: जंगली-प्रकार के पुरुष रिलीज अनुपात (प्रयोगात्मक चरण) के अनुसार तीन प्रतियों में सौंपा जाता है। पिंजरों ए (नियंत्रण) में कोई ट्रांसजेनिक प्यूपे नहीं जोड़ा गया है। मादाओं को साप्ताहिक रूप से एक ब्लडमील प्रदान किया जाता है और अंडे एकत्र किए जाते हैं, हैच किए जाते हैं, और प्यूपे में पाला जाता है। 30 नर और 30 मादा जंगली प्रकार के प्यूपे को उनके पिंजरों में वापस जोड़ा जाता है। पिंजरों 1: 1 में एक अतिरिक्त 30 ट्रांसजेनिक पुरुष प्यूपे जोड़ा गया है। पिंजरों 1: 0.1 में एक अतिरिक्त 300 ट्रांसजेनिक पुरुष प्यूपे जोड़ा गया है। 9 पिंजरों में से प्रत्येक से 300 लार्वा को यादृच्छिक रूप से चुना जाता है और फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए जांच की जाती है। इस प्रक्रिया को तब तक साप्ताहिक रूप से दोहराया गया जब तक कि ट्रांसजीन फिक्सेशन (कुछ पीढ़ियों के बाद ट्रांसजेनिक-वाइल्डटाइप मच्छरों का स्थिर अनुपात)। Pham et al से अनुकूलित. (2019) 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 2. पिंजरे की आबादी का रक्त खिलाना।  (ए) एनेस्थेटिक चूहों या (बी) हेमोटेक रक्त फीडरों को क्रमशः 0.216 एम 3 पिंजरों या छोटे 0.005 एम 3 पिंजरों पर मादा मच्छरों को खिलाने के लिए पेश किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 3. गैर-ड्राइव, ओवरलैपिंग जीन-ड्राइव और गैर-ओवरलैपिंग जीन-ड्राइव पिंजरे के परीक्षणों के लिए फेनोटाइप्स की स्क्रीनिंग।  एक लार्वा, प्यूपा और ट्रांसजेनिक या जंगली प्रकार के फेनोटाइप के वयस्क की फ्लोरोसेंट छवियां। इस उदाहरण में, An. stephensi व्यक्तियों को DsRed मार्कर के लिए जांच की गई थी जो आंखों में 3xP3 प्रमोटर द्वारा संचालित थी (DsRed + या DsRed-), सभी तीन चरणों में दिखाई देता है, और वयस्कों को सेक्स (♀ या ♂) के लिए जांच की गई थी। मिडगट में खाद्य बोलस से जुड़े जंगली-प्रकार के लार्वा में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पर ध्यान दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 4. अतिव्यापी जीन ड्राइव पिंजरे परीक्षण योजनाबद्ध.  छह 0.216 m3 पिंजरों को उनके जीन-ड्राइव के अनुसार तीन प्रतियों में स्थापित किया जाता है: जंगली-प्रकार के पुरुष रिलीज अनुपात। प्रत्येक पिंजरे में 120 जंगली-प्रकार के पुरुषों और 120 जंगली-प्रकार की मादाओं को जोड़ा गया था। 1: 1 जीन-ड्राइव पुरुष रिलीज अनुपात के साथ पिंजरों में अतिरिक्त 120 ट्रांसजेनिक पुरुष ों को जोड़ा गया था। 1: 10 पुरुष रिलीज अनुपात के साथ पिंजरों में अतिरिक्त 12 ट्रांसजेनिक पुरुष जोड़े गए थे। ट्रांसजीन के पूर्ण परिचय तक, हर 3 सप्ताह में, वयस्क मादाओं को रक्त के मांस के साथ प्रदान किया जाता है और अंडे एकत्र किए जाते हैं और हैच किए जाते हैं। कुल 240 लार्वा को यादृच्छिक रूप से चुना गया था और अपने संबंधित पिंजरों में वापस कर दिया गया था। तीन सौ (300) लार्वा को यादृच्छिक रूप से चुना जाता है और प्रमुख मार्कर के लिए स्क्रीन किया जाता है। उन्हें बाद में आंखों के रंग और सेक्स के लिए प्यूपे और वयस्कों के रूप में जांचा जाता है। मूल पिंजरों में कोई अतिरिक्त ट्रांसजेनिक नर नहीं जोड़ा जाता है। Pham et al से अनुकूलित. (2019) 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 5. गैर-अतिव्यापी जीन-ड्राइव पिंजरे परीक्षण योजनाबद्ध।  नौ छोटे 0.005 m3 पिंजरों को उनके जीन-ड्राइव के अनुसार तीन प्रतियों में स्थापित किया जाता है: जंगली-प्रकार के पुरुष रिलीज अनुपात। 1: 1 पुरुष रिलीज अनुपात वाले पिंजरों में 100 जंगली-प्रकार की मादाएं, 50 जंगली-प्रकार के पुरुष और 50 जीन-ड्राइव पुरुष जोड़े जाते हैं। 1: 3 पुरुष रिलीज अनुपात वाले पिंजरों में 100 जंगली-प्रकार की मादाएं, 75 जंगली-प्रकार के पुरुष और 25 जीन-ड्राइव पुरुष शामिल हैं। पिंजरों 1: 10 पुरुष रिलीज अनुपात में 100 जंगली प्रकार की मादाएं, 90 जंगली प्रकार के पुरुष, और 9 जीन-ड्राइव पुरुष जोड़े गए हैं। मादाओं को एक रक्त भोजन प्रदान किया जाता है और अंडे एकत्र किए जाते हैं और हैच किए जाते हैं। 1: 1 और 1: 3 पिंजरों के लिए, 200 लार्वा को बेतरतीब ढंग से चुना जाता है और अगली पीढ़ी के लिए अपने माता-पिता से अलग नए पिंजरों को पॉप्युलेट करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक अतिरिक्त 500 लार्वा को यादृच्छिक रूप से चुना जाता है और प्यूपे में पाला जाता है, जब उन्हें प्रमुख मार्कर जीन के लिए स्क्रीन किया जाता है। 500 प्यूपे को फिर वयस्कों में पाला जाता है और सेक्स द्वारा स्कोर किया जाता है। मार्कर के लिए शेष सभी लार्वा की जांच की जाती है। 1: 10 पिंजरों के लिए, सभी लार्वा को 1-12 पीढ़ियों में स्कोर किया जाता है और मौजूदा ट्रांसजीन आवृत्ति को दर्शाने वाले 200 लार्वा का उपयोग नए पिंजरों को पॉप्युलेट करने के लिए किया जाता है। पीढ़ी 13 से शुरू करते हुए, इन पिंजरों को 1: 1 और 1: 3 पिंजरों के समान रूप से स्थापित किया गया है। Pham et al से अनुकूलित. (2019) 2 और Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 6. विभिन्न जनसंख्या प्रतिस्थापन पिंजरे परीक्षणों के लिए ट्रांसजीन निर्धारण गतिशीलता की भविष्यवाणी की।  Pham et al द्वारा किए गए पिंजरे के परीक्षणों में से प्रत्येक के लिए सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाली प्रतिकृतियों की अपेक्षित फेनोटाइप गतिशीलता का प्रतिनिधित्व। (2019) 2, 7 पीढ़ियों से अधिक की निगरानी की। प्रोटोकॉल में सेट अप किए गए प्रयोगों का वर्णन किया गया है। भविष्यवाणियां 1: 1 रिलीज मॉडल पर सभी 9 प्रयोगों के डेटा पर आधारित हैं (तीन अलग-अलग पिंजरे परीक्षण प्रोटोकॉल में से प्रत्येक के लिए प्रतिलिपि प्रतिलिपि)। एक्स-अक्ष प्रारंभिक परिचय के बाद पीढ़ी की संख्या है और वाई-अक्ष लार्वा का अनुपात है जो समय के साथ DsRed मार्कर फेनोटाइप (DsRed +) दिखाता है। डैश्ड लाइनें डेटा की रैखिक ट्रेंडलाइनों का प्रतिनिधित्व करती हैं। DsRed + फेनोटाइप संशोधित एलील की कम से कम एक प्रतिलिपि होने के परिणामस्वरूप होता है। इसलिए परिणाम ट्रांसजीन के प्रसार को दर्शाते हैं, जीन ड्राइव सिस्टम में तेजी से, अवलोकन के अंत में (पास) पूर्ण परिचय तक पहुंचते हैं। प्रतिकृति और प्रयोगों पर पूर्ण विस्तृत डेटा के बीच परिवर्तनशीलता के लिए, कृपया Pham et al को देखें। (2019) 2, Carballar-Lejarazú R et al. (2020)3 और Adolfi A et al. (2020)4. Pham TB et al. (2019) मलेरिया वेक्टर मच्छर, Anopheles stephensi के प्रयोगात्मक जनसंख्या संशोधन से अनुकूलित छवियां। PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A et al. (2020) मलेरिया मच्छर Anopheles stephensi में कुशल जनसंख्या संशोधन जीन-ड्राइव बचाव प्रणाली। Nat Commun 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 और Carballar-Lejarazú R et al. (2020) मलेरिया वेक्टर मच्छर, Anopheles gambiae की जनसंख्या संशोधन के लिए अगली पीढ़ी के जीन ड्राइव। Proc Natle Acad Sci USA 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. पूरक फ़ाइल: 0.005 m3 कॉलोनी पिंजरे का निर्माण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मच्छर जिनमें रोगज़नक़ अवरुद्ध करने की क्षमता होती है या बाँझपन जीन सहन करते हैं, वेक्टर जनित बीमारियों को नियंत्रित करने के लिए नए उपकरण ों का गठन करते हैं। इन वैकल्पिक दृष्टिकोणों को शामिल करने वाले मापदंडों की बहुलता को देखते हुए, उनके शोध में एक महत्वपूर्ण कदम में प्रयोगशाला-सीमित प्रयोगात्मक मूल्यांकन शामिल हैं जो नियंत्रण उद्देश्यों के लिए सिंथेटिक ट्रांसजीन रिलीज के संभावित परिणामों की तेज और सुरक्षित भविष्यवाणी की अनुमति देते ^हैं1।

क्योंकि पिंजरे में बंद आबादी में ट्रांसजीन गतिशीलता की निगरानी कई महीनों तक बढ़ सकती है, प्रोटोकॉल के केंद्रीय पहलुओं में से एक प्रतिकृति के बीच प्रयोगात्मक डिजाइन में स्थिरता है (मच्छर पालन, पिंजरे का आकार, आयु-संरचित आबादी, निश्चित रिलीज अनुपात, स्थिर रक्त भोजन स्रोत और न्यूनतम इनवेसिव स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं सहित)।

पुरुष-केवल रिलीज को आदर्श माना जाता है क्योंकि पुरुष मच्छर न तो रोगजनकों को प्रसारित करते हैं और न ही मनुष्यों पर फ़ीड करते हैं, इसलिए वे सुरक्षित रूप से जंगली आबादी में वंशानुगत विशेषताओं को पेश कर सकते हैं। प्रयोगशाला पिंजरे के प्रयोगों में, ट्रांसजेनिक उपभेदों को कम पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा और ट्रांसजीन एकीकरण से जुड़े अन्य फिटनेस भार के साथ पता लगाना संभव है। हालांकि, प्रत्यक्ष और विशिष्ट प्रयोग, जैसे कि बड़े पिंजरों ¹⁰ में आयोजित किए गए, पुरुष प्रतिस्पर्धा त्मकता का ठीक से विश्लेषण करने के लिए आयोजित किया जा सकता है, साथ ही साथ अधिक प्राकृतिक मच्छर घनत्व में मादा प्रजनन ²। इसके अलावा, पिंजरे के परीक्षणों से अनुभवजन्य डेटा का उपयोग पिंजरे की आबादी की गतिशीलता के मॉडल को पैरामीटर करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें प्रतिरोधी एलील गठन शामिल है, और प्रस्तावित तकनीक में प्रभावशीलता और संभावित समायोजन पर उपयोगी जानकारी प्रदान करता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से आवश्यकतानुसार अन्य प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, नियमित कीटनाशक बुनियादी ढांचे और स्थितियों के बारे में न्यूनतम आवश्यकताओं के साथ। इसके अलावा, वाणिज्यिक पिंजरों और माइक्रोस्कोप को छोड़कर, अधिकांश सामग्री सस्ती हैं और परीक्षणों की कम लागत वाली कई प्रतिकृतियों और पुनरावृत्तियों की अनुमति देती हैं। विशेष रूप से, यह कई ट्रांसजेनिक उपभेदों को छोटे पिंजरे के परीक्षणों में पूर्व-स्क्रीनिंग करने की अनुमति देता है ताकि सर्वोत्तम प्रदर्शन करने वाले उम्मीदवारों को चरणबद्ध परीक्षण मार्ग में आगे बढ़ने और उप-इष्टतम प्रदर्शन दिखाने वालों पर परीक्षण को निलंबित करने के लिए प्राथमिकता दी जा सके।

अंत में, आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों के उपयोग के बारे में चिंता मच्छर जनित बीमारियों की रोकथाम के लिए आनुवंशिक रणनीतियों के विकास, मूल्यांकन और अनुप्रयोग के लिए ढांचे के विस्तार को प्रेरित करती ^है5,8,9। यहां परिभाषित प्रोटोकॉल की प्रासंगिकता और निष्पादन इन दिशानिर्देशों के अनुरूप हैं।

Materials

Artificial feeders	Hemotek	SP6W1-3	Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs
Cage, commercial	BioQuip	1450D	Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" – 0.216 m3 (60 cm3)
Cage tub (popcorn)	Amazon.com	VP170-0006	0.005 m3 (170 fl oz)
Dissecting microscope with fluorescence light and filters	Leica	M165FC
Glue sticks	Michaels	88646598807	Gluesticks 40 pk,  0.4X4”
Hot glue gun	Woodwards Ace	2382513	Stanley, 40 watt, GR20
Nylon screen (netting)	Joann.com	1102912	Tulle 108" Wide x 50 Yds – ~35.6 cm2 (14 in2)
Oviposition cups	Fisher	259126	Beaker PP grad 50 mL
Razor cutting tool	Office Depot	487899	Box cutters
Scissors	Office Depot	978561	Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8"
Stapler	Office Depot	908194	Swingline Commercial Desk Stapler
Surgical sleeve (stockinette)	VWR	56612-664	~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y)
Zip ties	Home Depot	295715	Pk of 100, 14” cable ties – 35.6 cm (14 in)