यहां रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल प्रयोगशाला-निहित छोटे पिंजरे के परीक्षणों में वेक्टर नियंत्रण के लिए नियत आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मच्छरों के प्रदर्शन का आकलन करने के तीन वैकल्पिक तरीकों को दर्शाते हैं। प्रत्येक प्रोटोकॉल को विशिष्ट संशोधन मच्छर तनाव भालू (जीन ड्राइव या गैर-जीन ड्राइव) और मापा मापदंडों के प्रकारों के अनुरूप है।
आनुवांशिक रूप से संशोधित वैक्टरों का उपयोग करके मच्छर-जनित रोगजनकों के नियंत्रण को पारंपरिक नियंत्रण रणनीतियों के पूरक के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। CRISPR-आधारित होमिंग जीन ड्राइव सिस्टम ने ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियों को वैज्ञानिक समुदाय के भीतर अधिक सुलभ बना दिया है। ट्रांसजेनिक मच्छर के प्रदर्शन का मूल्यांकन और छोटे प्रयोगशाला पिंजरे के परीक्षणों में जंगली-प्रकार के समकक्षों के साथ तुलना रोग की रोकथाम के लिए रणनीतियों को परिष्कृत करने के लिए बाद के क्षेत्र पिंजरे के प्रयोगों और प्रयोगात्मक आकलनों के डिजाइन के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान करती है। यहां, हम मलेरिया के एनोफिलिन मच्छर वैक्टर में फैलने वाले ट्रांसजीन का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोगशाला सेटिंग्स में उपयोग किए जाने वाले तीन अलग-अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इनमें निष्क्रिय रिलीज (कोई जीन-ड्राइव सिस्टम नहीं), और जीन-ड्राइव ओवरलैपिंग और गैर-ओवरलैपिंग पीढ़ी के परीक्षण शामिल हैं। तीन परीक्षण कई मापदंडों में भिन्न होते हैं और उन्हें वांछित प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, छोटे पिंजरों में कीटीय अध्ययन प्रयोगशाला से खुले क्षेत्र रिलीज के लिए इंजीनियर कीड़ों के प्रगतिशील संक्रमण का हिस्सा हैं। इसलिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल अनुभवजन्य मूल्यों को प्रदान करने के लिए अमूल्य उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो अंततः मलेरिया उन्मूलन के लिए नई प्रौद्योगिकियों के क्षेत्र कार्यान्वयन में सहायता करेंगे।
आनुवांशिक रूप से इंजीनियर मच्छरों पर आधारित कार्यनीतियों को वेक्टर जनित रोगजनकों के संचरण को नियंत्रित करने के लिए अपनाया जा रहा है जैसे कि मलेरिया का कारण बनता है। इनमें प्रौद्योगिकियां शामिल हैं 1) एनोफिलीज़ मच्छरों (जनसंख्या दमन) की संख्या और घनत्व को कम करने के उद्देश्य से, या 2) का उद्देश्य मानव रोग (जनसंख्या संशोधन, प्रतिस्थापन, या परिवर्तन) के लिए जिम्मेदार परजीवी को संचारित करने के लिए वैक्टर की क्षमता को कम करना है, जिसमें वैक्टर के उपभेदों को प्रभावक जीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जाता है जो रोगज़नक़ संचरण को रोकते हैं। इन आनुवांशिक दृष्टिकोणों को CRISPR / Cas9-आधारित जीन ड्राइव के आगमन से बल मिला है, जिसमें पेलोड लक्षणों के प्रभावी प्रसार के परजीवी-संचारण मच्छरों के साथ-साथ पिंजरे में बंद आबादी में एंटी-परजीवी प्रभावक अणुओं के प्रमाण-की-अवधारणा है।
छोटे प्रयोगशाला पिंजरे के परीक्षण क्षेत्र अनुप्रयोगों की ओर उनके आगे के विकास के लिए एक चरणबद्ध दृष्टिकोण के हिस्से के रूप में ट्रांसजेनिक उपभेदों की विशेषता का मूल्यांकन करने के लिए एक पहला कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं2। विशिष्ट परिणाम विचारों में एक प्रतिस्पर्धी वातावरण में पेश किए गए डीएनए की वंशानुगतता, फेनोटाइप की पेनेट्रेंस और अभिव्यक्ति, और स्थिरता शामिल हैं। प्रासंगिक प्रयोगात्मक डिजाइन सुविधाओं में पिंजरों का आकार, मच्छर घनत्व, प्रतिकृतियों की संख्या, ओवरलैपिंग या गैर-अतिव्यापी पीढ़ियों, आयु-संरचित लक्ष्य आबादी, इंजीनियर उपभेदों के एकल या कई रिलीज, केवल पुरुष-केवल, केवल महिला-या मिश्रित-सेक्स रिलीज, रिलीज अनुपात, रक्त भोजन स्रोत (कृत्रिम या जीवित पशु), और स्क्रीनिंग प्रक्रियाएं शामिल हैं।
हम यहां उन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो कि अनचाहेतुक रिलीज (कोई जीन-ड्राइव सिस्टम नहीं) के लिए एनोफेलिन मच्छरों के उपभेदों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं और जो कैस 9 एंडोन्यूक्लिएज द्वारा मध्यस्थता वाले स्वायत्त जीन-ड्राइव सिस्टम को ले जाते हैं और आरएनए (जीआरएनए) का मार्गदर्शन करते हैं। इन प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग Pham et al में दिखाई देते हैं। (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, और एडॉल्फी एट अल। (2020) ४ ।
Inundative रिलीज परीक्षण एक जंगली आबादी में ट्रांसजेनिक मच्छरों की एक बड़ी संख्या के कई रिलीज के बाद मेंडेलियन विरासत के तहत एक डिजाइन ट्रांसजीन की प्रसार दर का मूल्यांकन करते हैं। एक ड्राइव सिस्टम के लिए ट्रांसजीन के लगाव के बिना, निष्क्रिय रिलीज परीक्षणों से डेटा एक स्थिर आबादी में ब्याज के ट्रांसजीन की फिटनेस और गतिशील के बारे में जानकारी प्रदान करता है।
जब मच्छरों की आबादी में एक स्वायत्त जीन-ड्राइव प्रणाली होती है, तो छोटे पिंजरे के परीक्षणों को ट्रांसजेनिक पुरुषों के एकल परिचय के बाद प्रमुख मार्कर वृद्धि की दर का निर्धारण करके वांछित ट्रांसजीन के प्रसार की गतिशीलता का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। स्वायत्त जीन-ड्राइव तत्व Cas9 न्यूक्लिएज, gRNA और प्रमुख मार्कर को एन्कोडिंग करने वाले जीनों को इस तरह के फैशन में जोड़ते हैं जो बाद की पीढ़ियों में सक्रिय होने के लिए इस तरह से जुड़े होते हैं।
‘ओवरलैपिंग’ पीढ़ियां एक उम्र-संरचित निरंतर आबादी बनाने के लिए एक ही पिंजरे में कई पीढ़ियों की एक साथ उपस्थिति को संदर्भित करती हैं, जबकि ‘गैर-ओवरलैपिंग’ प्रत्येक लगातार पिंजरे में बंद आबादी में एकल असतत पीढ़ियों को संदर्भित करता है2। जीन-ड्राइव पिंजरे के प्रयोगों को समाप्त किया जा सकता है एक बार ड्राइव (रूपांतरण) दर की प्रारंभिक गतिशीलता निर्धारित की जा सकती है (निर्माण के आधार पर 8-10 पीढ़ियां), और जब वे मच्छर आबादी के भीतर ट्रांसजीन की अल्पकालिक स्थिरता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, तो वे यह प्रकट नहीं कर सकते हैं कि जब और यदि प्रमुख मार्कर आवृत्तियां पूर्ण परिचय तक पहुंचती हैं या उनके करीब होती हैं (जीन-ड्राइव सिस्टम की कम से कम एक प्रति लिपि ले जाने वाला प्रत्येक मच्छर)।
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मच्छर जिनमें रोगज़नक़ अवरुद्ध करने की क्षमता होती है या बाँझपन जीन सहन करते हैं, वेक्टर जनित बीमारियों को नियंत्रित करने के लिए नए उपकरण ों का गठन करते हैं। इन वैकल्पिक दृष्टिकोणों को शामिल करने वाले मापदंडों की बहुलता को देखते हुए, उनके शोध में एक महत्वपूर्ण कदम में प्रयोगशाला-सीमित प्रयोगात्मक मूल्यांकन शामिल हैं जो नियंत्रण उद्देश्यों के लिए सिंथेटिक ट्रांसजीन रिलीज के संभावित परिणामों की तेज और सुरक्षित भविष्यवाणी की अनुमति देते हैं1।
क्योंकि पिंजरे में बंद आबादी में ट्रांसजीन गतिशीलता की निगरानी कई महीनों तक बढ़ सकती है, प्रोटोकॉल के केंद्रीय पहलुओं में से एक प्रतिकृति के बीच प्रयोगात्मक डिजाइन में स्थिरता है (मच्छर पालन, पिंजरे का आकार, आयु-संरचित आबादी, निश्चित रिलीज अनुपात, स्थिर रक्त भोजन स्रोत और न्यूनतम इनवेसिव स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं सहित)।
पुरुष-केवल रिलीज को आदर्श माना जाता है क्योंकि पुरुष मच्छर न तो रोगजनकों को प्रसारित करते हैं और न ही मनुष्यों पर फ़ीड करते हैं, इसलिए वे सुरक्षित रूप से जंगली आबादी में वंशानुगत विशेषताओं को पेश कर सकते हैं। प्रयोगशाला पिंजरे के प्रयोगों में, ट्रांसजेनिक उपभेदों को कम पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा और ट्रांसजीन एकीकरण से जुड़े अन्य फिटनेस भार के साथ पता लगाना संभव है। हालांकि, प्रत्यक्ष और विशिष्ट प्रयोग, जैसे कि बड़े पिंजरों 10 में आयोजित किए गए, पुरुष प्रतिस्पर्धा त्मकता का ठीक से विश्लेषण करने के लिए आयोजित किया जा सकता है, साथ ही साथ अधिक प्राकृतिक मच्छर घनत्व में मादा प्रजनन 2। इसके अलावा, पिंजरे के परीक्षणों से अनुभवजन्य डेटा का उपयोग पिंजरे की आबादी की गतिशीलता के मॉडल को पैरामीटर करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें प्रतिरोधी एलील गठन शामिल है, और प्रस्तावित तकनीक में प्रभावशीलता और संभावित समायोजन पर उपयोगी जानकारी प्रदान करता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से आवश्यकतानुसार अन्य प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, नियमित कीटनाशक बुनियादी ढांचे और स्थितियों के बारे में न्यूनतम आवश्यकताओं के साथ। इसके अलावा, वाणिज्यिक पिंजरों और माइक्रोस्कोप को छोड़कर, अधिकांश सामग्री सस्ती हैं और परीक्षणों की कम लागत वाली कई प्रतिकृतियों और पुनरावृत्तियों की अनुमति देती हैं। विशेष रूप से, यह कई ट्रांसजेनिक उपभेदों को छोटे पिंजरे के परीक्षणों में पूर्व-स्क्रीनिंग करने की अनुमति देता है ताकि सर्वोत्तम प्रदर्शन करने वाले उम्मीदवारों को चरणबद्ध परीक्षण मार्ग में आगे बढ़ने और उप-इष्टतम प्रदर्शन दिखाने वालों पर परीक्षण को निलंबित करने के लिए प्राथमिकता दी जा सके।
अंत में, आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों के उपयोग के बारे में चिंता मच्छर जनित बीमारियों की रोकथाम के लिए आनुवंशिक रणनीतियों के विकास, मूल्यांकन और अनुप्रयोग के लिए ढांचे के विस्तार को प्रेरित करती है5,8,9। यहां परिभाषित प्रोटोकॉल की प्रासंगिकता और निष्पादन इन दिशानिर्देशों के अनुरूप हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम मच्छर पालन के लिए Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish पॉवेल और Madeline Nottoli के आभारी हैं। वित्त पोषण कैलिफोर्निया इरविन मलेरिया पहल विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया था। AAJ कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में एक डोनाल्ड ब्रेन प्रोफेसर है।
Artificial feeders | Hemotek | SP6W1-3 | Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs |
Cage, commercial | BioQuip | 1450D | Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" – 0.216 m3 (60 cm3) |
Cage tub (popcorn) | Amazon.com | VP170-0006 | 0.005 m3 (170 fl oz) |
Dissecting microscope with fluorescence light and filters | Leica | M165FC | |
Glue sticks | Michaels | 88646598807 | Gluesticks 40 pk, 0.4X4” |
Hot glue gun | Woodwards Ace | 2382513 | Stanley, 40 watt, GR20 |
Nylon screen (netting) | Joann.com | 1102912 | Tulle 108" Wide x 50 Yds – ~35.6 cm2 (14 in2) |
Oviposition cups | Fisher | 259126 | Beaker PP grad 50 mL |
Razor cutting tool | Office Depot | 487899 | Box cutters |
Scissors | Office Depot | 978561 | Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8" |
Stapler | Office Depot | 908194 | Swingline Commercial Desk Stapler |
Surgical sleeve (stockinette) | VWR | 56612-664 | ~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y) |
Zip ties | Home Depot | 295715 | Pk of 100, 14” cable ties – 35.6 cm (14 in) |