Preparazione della membrana plasmatica su piccola scala per l'analisi di Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Golnoush Madani; Erwin Lamping; Hee Ji Lee; Masakazu Niimi; Alok K. Mitra; Richard D. Cannon

doi:10.3791/62592

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Articolo metodologico

Preparazione della membrana plasmatica su piccola scala per l'analisi di Candida albicans Cdr1-mGFPHis

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DOI:

10.3791/62592

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13 giugno 2021

Golnoush Madani^*¹ , Erwin Lamping^*¹ , Hee Ji Lee¹ , Masakazu Niimi¹^,² , Alok K. Mitra³ , Richard D. Cannon¹

¹Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, ²Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, ³School of Biological Sciences, University of Auckland

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo di isolamento della membrana plasmatica su piccola scala per la caratterizzazione della proteina Cdr1 della Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), sovraespressa in Saccharomyces cerevisiae. Un doppio tag mGFPHis C-terminale scisso con un linker a 16 residui tra Cdr1 e il tag è stato progettato per facilitare la purificazione e lo screening detergente di Cdr1.

Abstract

Il successo della caratterizzazione biochimica e biofisica dei trasportatori ABC dipende fortemente dalla scelta del sistema di espressione eterologa. Negli ultimi due decenni, abbiamo sviluppato una piattaforma di espressione proteica della membrana del lievito che è stata utilizzata per studiare molte importanti proteine di membrana fungina. L'espressione ospite Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ viene cancellata in sette principali trasportatori ABC endogeni e contiene il fattore di trascrizione Pdr1-3 con una mutazione gain-of-function che consente la sovraespressione costitutiva di geni proteici di membrana eterologhi stabilmente integrati come copie singole nel locus genomico PDR5. La creazione di vettori plasmidici versatili e l'ottimizzazione di strategie di clonazione in un'unica fase consente la clonazione, la mutagenesi e l'espressione rapide e accurate dei trasportatori ABC eterologhi. Qui, descriviamo lo sviluppo e l'uso di un nuovo tag mGFPHis a cleavable per la proteasi (cioè, la proteina fluorescente verde potenziata dal lievito monomerico yEGFP3 fusa a un tag di purificazione dell'affinità a sei istidine) che è stato progettato per evitare possibili interferenze del tag con la proteina di interesse e per aumentare l'efficienza di legame del tag His alle resine di affinità al nichel. La fusione di mGFPHis alla proteina di membrana ORF (open reading frame) consente una facile quantificazione della proteina mediante l'ispezione dei gel di poliacrilammide e il rilevamento dei prodotti di degradazione che conservano il tag mGFPHis. Dimostriamo come questa caratteristica faciliti lo screening dei detergenti per la solubilizzazione delle proteine di membrana. Viene presentato un protocollo per l'isolamento efficiente, veloce e affidabile dei preparati di membrana plasmatica su piccola scala del trasportatore multiplo di efflusso Cdr1 marcato C-terminalmente etichettato come Candida albicans Cdr1 sovraespresso in S. cerevisiae ADΔΔ. Questo protocollo di isolamento della membrana plasmatica su piccola scala genera membrane plasmatiche di alta qualità in un solo giorno lavorativo. I preparati di membrana plasmatica possono essere utilizzati per determinare le attività enzimatiche delle varianti mutanti Cdr1 e Cdr1.

Introduzione

L'estrazione di proteine di membrana integrali dal loro ambiente lipidico nativo può influenzare notevolmente la loro struttura e funzione^1,^2,^3,^4. La complessa composizione lipidica delle membrane biologiche⁵ assicura che possano verificarsi interazioni proteina-lipidi di importanza critica⁶. I lipidi mantengono l'integrità strutturale delle proteine di membrana, consentendo loro di funzionare correttamente nelle loro destinazioni del compartimento di membrana⁷^,