Proteiner og aminholdige ligander kan være kovalent forbundet med polysaccharider aktiveret af cyanylation reagens, 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat (CDAP), til at danne kovalent protein (ligand)-polysaccharid konjugates. I denne artikel beskrives en forbedret protokol til udførelse af kontrolleret CDAP-aktivering ved 0 °C og varierende pH og efterfølgende bøjning af de aktiverede polysaccharider.
Konjugatvacciner er bemærkelsesværdige fremskridt inden for vaccinologi. Til fremstilling af polysaccharidkonjugatvacciner kan polysaccharider bekvemt funktionaliseres og forbindes med vaccinebærerproteiner ved hjælp af 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat (CDAP), et cyanylende reagens, der er let at håndtere. CDAP aktiverer polysaccharider ved at reagere med kulhydrathydrathydrxylgrupper ved pH 7-9. Stabiliteten og reaktiviteten af CDAP er meget pH-afhængige. Reaktionens pH-fejl falder også under aktiveringen på grund af hydrolysen af CDAP, hvilket gør god pH-styring af nøglen til reproducerbar aktivering. Den oprindelige CDAP-aktiveringsprotokol blev udført ved stuetemperatur i ikke-byggede pH 9-løsninger.
På grund af den hurtige reaktion under denne tilstand (<3 min) og det medfølgende hurtige pH-fald fra den hurtige CDAP-hydrolyse var det udfordrende hurtigt at justere og vedligeholde målreaktions-pH'en inden for den korte tidsramme. Den forbedrede protokol, der er beskrevet her, udføres ved 0 °C, hvilket bremser CDAP-hydrolyse og forlænger aktiveringstiden fra 3 min til ~ 15 min. Dimethylaminopyridin (DMAP) blev også brugt som buffer til at justere polysaccharidopløsningen til målaktiverings-pH'en, før CDAP-reagenset blev tilføjet. Den længere reaktionstid kombineret med den langsommere CDAP-hydrolyse og brugen af DMAP-buffer gør det lettere at opretholde aktiverings-pH'en i hele aktiveringsprocessens varighed. Den forbedrede protokol gør aktiveringsprocessen mindre hektisk, mere reproducerbar og mere modtagelig for opskalering.
Konjugatvacciner, såsom dem, der består af polysaccharider, der er kovalent forbundet med et bæreprotein, er blandt de bemærkelsesværdige fremskridt inden for vaccinologi1,2. Polysaccharider, som T-celle-uafhængige antigener, er dårligt immunogene hos spædbørn og fremkalder ikke hukommelse, klasseskift eller affinitetsmodning af antistoffer3. Disse mangler overvindes i polysaccharid konjugatvacciner4. Da de fleste polysaccharider ikke har et praktisk kemisk håndtag til bøjning, skal de først gøres reaktive eller “aktiveres”. Den aktiverede polysaccharid forbindes derefter enten direkte med proteinet (eller modificeret protein) eller funktionaliseres til yderligere derivatisering førbøjning 4. De fleste licenserede polysaccharid konjugatvacciner bruger enten reduktiv amination eller cyanylation til at aktivere polysaccharid hydroxyls. Cyanogenbromid (CNBr), et reagens, der tidligere var blevet brugt til at aktivere kromatografiharpikser, blev oprindeligt brugt til polysaccharidderivatisering. CNBr kræver dog høj pH, typisk ~ pH 10,5 eller derover, for delvist at deprotonere polysaccharid hydroxyls, så de er tilstrækkeligt nukleophilic til at angribe cyanogruppen. Den høje pH-fejl kan være skadelig for basis-labile polysaccharider, og hverken CNBr eller den aktive cyano-ester, der oprindeligt blev dannet, er tilstrækkelig stabil ved så høj pH.
CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat; Figur 1) blev indført af Lees et al. til brug som cyanylerende middel til aktivering af polysaccharider5,6. CDAP, som er krystallinsk og let at håndtere, viste sig at aktivere polysaccharider ved en lavere pH end CNBr og med færre bivirkninger. I modsætning til CNBr kan CDAP-aktiverede polysaccharider konjugeres direkte til proteiner, hvilket forenkler synteseprocessen. CDAP-aktiverede polysaccharider kan funktionaliseres med en diamin (f.eks. hexanediamin) eller et dihydrazid (f.eks. adipic dihydrazid, ADH) for at fremstille amino- eller hydrazidderivatiserede polysaccharider. En høj koncentration af det homobifunktionelle reagens bruges til at undertrykke krydskædning af polysaccharider. Amino polysaccharider kan derefter konjugers ved hjælp af nogen af de utallige teknikker, der anvendes til protein bøjning. Hydrazid-derivatiserede polysaccharider er ofte koblet til proteiner ved hjælp af et carbodiimid reagens (f.eks. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC))7. Yderligere optimering af CDAP polysaccharid aktivering er blevet beskrevet af Lees et al.8 og er indarbejdet i protokollen beskrevet her.
OVERSIGT OVER CDAP-bøjning
CDAP-protokollen kan konceptualiseres som to faser: (1) aktivering af polysaccharid og (2) bøjning af det aktiverede polysaccharid med et protein eller ligand (figur 2). Målet med det første skridt er effektivt at aktivere polysaccharid, mens målet med det andet er effektivt at konjugere til den aktiverede polysaccharid. Den aktiverede polysaccharid binder de to trin sammen. Denne konceptualisering hjælper med at fokusere på de kritiske elementer i hvert trin. Figur 2 udvider denne konceptualisering, der viser de ønskede aktiverings- og koblingsreaktioner sammen med hydrolysereaktionerne og bivirkningerne.
I aktiveringsfasen er de tre største bekymringer CDAP-stabilitet, CDAP-reaktion med polysaccharidhydrxyl og stabiliteten af det aktiverede polysaccharid (figur 3). CDAP hydrolyse stiger med pH, ligesom hydrolyse af den aktiverede polysaccharid og sidereaktionerne. CDAP-reaktionen med polysaccharid lettes dog ved at øge pH-markedet. Effektiv aktivering af polysaccharider med CDAP kræver en balance mellem 1) polysaccharidens og CDAP’s reaktivitet og 2) hydrolyse og sidereaktioner fra både reagenset og det aktiverede polysaccharid.
I den oprindelige CDAP-aktiveringsprotokol, der er beskrevet af Lees et al.5, blev CDAP-aktivering af polysaccharider udført ved stuetemperatur i ukøbt pH 9-opløsning. Aktiveringshastigheden viste sig at være hurtig under denne betingelse, og aktiveringen ville være komplet inden for 3 min. Reaktionen blev også ledsaget af hurtig hydrolyse af CDAP, hvilket forårsagede et hurtigt pH-fald i den ikke-byggede reaktionsløsning. Det var udfordrende hurtigt at hæve og opretholde reaktionen pH på målværdien i så kort tid. I den beskrevne protokol blev aktiveringen udført ved at tilføje CDAP fra en 100 mg / mL lageropløsning til den ikke-byggede polysaccharidopløsning. pH blev hævet 30 s senere med “et lige volumen på 0,2 M triethylamin”. Protein, der skal konjugers blev derefter tilsat efter 2,5 min til aktiveringsreaktionen. Navnlig var pH-adressen på aktiveringstrinnet ikke velkontrolleret og overskred sandsynligvis oprindeligt mål-pH’en. Den hurtige reaktion, der kræver hurtig pH-justering, gjorde aktiveringsprocessen vanskelig at kontrollere og udfordrende at skalere op.
I modsætning til den oprindelige protokol har den ændrede protokol, der er beskrevet her, to store forbedringer. For det første er polysaccharidopløsningens pH-pH-side justeret til målaktivering af pH ved hjælp af DMAP som buffer før tilsætning af CDAP. DMAP har en pKa på 9,5 og har således god buffereffekt omkring pH 9, og i modsætning til mange andre buffere blev DMAP ikke fundet at fremme CDAP hydrolyse8. Desuden er DMAP allerede en proces mellemliggende og tilføjer derfor ikke en ny komponent til reaktionsblandingen. Forjustering af pH-vedligeholdelsen, før cdap tilføjes, eliminerer det store pH-sving i begyndelsen af reaktionen og giver mulighed for en mere effektiv vedligeholdelse af mål-pH’en under reaktionen. Den anden forbedring er at udføre aktiveringsreaktionen ved 0 °C, hvor CDAP-hydrolysehastigheden er markant langsommere end ved stuetemperatur. Med den længere halveringstid i reagens ved 0 °C øges aktiveringstiden fra 3 min til 15 min for at kompensere for den langsommere aktiveringshastighed ved den lavere temperatur. Den længere reaktionstid gør det igen lettere at opretholde reaktions-pH-virksomheden. Anvendelsen af 0 °C forsinker også nedbrydningen af pH-følsomme polysaccharider, hvilket gør det muligt at forberede konjuger af denne type polysaccharid. Forbedringerne i protokollen gør aktiveringsprocessen mindre hektisk, lettere at kontrollere, mere reproducerbar og mere modtagelig for opskalering.
I denne artikel beskrives den forbedrede protokol til udførelse af kontrolleret CDAP-aktivering af polysaccharid ved 0 °C og ved en bestemt mål-pH-værdi og efterfølgende derivatisering af de aktiverede polysaccharider med ADH. Også beskrevet er en trinitrobenzene sulfatsyre (TNBS) assay, baseret på metoden qi et al.9, til bestemmelse af hydrazid niveau på den modificerede polysaccharid. En modificeret analyse for hexoser baseret på resorcinol og svovlsyre10 er også beskrevet, som kan bruges til bestemmelse af en bredere vifte af polysaccharider. For mere information om CDAP aktivering og bøjning, læseren henvises til tidligere publikationer5,6,8 af Lees et al.
CDAP er en bekvem reagens til at derivatize og konjugere polysaccharider. I denne artikel beskrives den generelle metode til at bruge CDAP til at derivatisere polysaccharider med hydrazider (PS-ADH) og indeholder nyligt offentliggjorte forbedringer8. For det første understreger teknikken vigtigheden af at opretholde mål-pH’en for at styre aktiveringsprocessen. Vi fandt ud af, at mens mange almindelige buffere forstyrrer CDAP-aktiveringsreaktionen, kunne DMAP med succes bruges som buffer til at administrere pH8. Desuden er DMAP allerede et reaktionsbiprodukt af CDAP-aktivering. Endelig letter buffering af polysaccharidopløsningen med DMAP, før CDAP tilføjes, præcis målretning og vedligeholdelse af reaktions-pH’en. Som vi beskriver, er det nyttigt at justere pH af den koncentrerede DMAP lageropløsning, så når den fortyndes, når den den målrettede pH. For det andet bremsede udførelsen af processen i kulden reaktionstiden, hvilket gjorde aktiveringsprocessen mindre hektisk og mere tilgivende. Lavere temperatur faldt hastigheden af CDAP hydrolyse, og den optimale aktiveringstid ved pH 9 stiger fra ~ 3 min til ~ 15 min. Derudover kræves der mindre CDAP for at opnå det samme aktiveringsniveau, end når det udføres ved stuetemperatur.
ADH-derivatiserede polysaccharider kan konjugeres til proteiner ved hjælp af carbodiimider (f.eks. For eksempel bruger flere godkendte Hæmophilus influenzae b (Hib) vacciner polyribosylribitolphosphat (PRP), derivatized med ADH til at konjugatere til stivkrampe toksoid ved hjælp af EDAC. CNBR blev oprindeligt ansat, men CDAP er et meget lettere reagens at bruge til dette formål. Det er vores erfaring, at et godt målområde for ADH-derivatisering er 10-30 hydrazider pr. 100 kDa polysaccharid eller ~ 1-3% ADH efter vægt.
Den samme proces kan bruges til at derivatisere polysaccharider med primære aminer ved at erstatte ADH for en diamin. Det anbefales at bruge hexandiamin til at derivatisere polysaccharider med aminer8. Den aminerede polysaccharid (PS-NH2) kan konjugeres ved hjælp af reagenser udviklet til proteinbøjning11. Typisk er PS-NH2 derivatiseret med en maleimid (f.eks. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylat (SMCC) eller N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimid ester (GMBS)), og proteinet thioleres (f.eks. med succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)). Thiol-maleimide kemi er meget effektiv.
Proteiner kan også være direkte koblet til CDAP-aktiverede polysaccharider via ɛ-amine på lysiner. Mens den anvendte aktiveringsprotokol generelt ligner den, der er beskrevet her, er det nødvendigt at optimere aktiveringsniveauet, polysaccharid og proteinkoncentration samt protein:polysaccharidforholdet5,6,8.
Dextran er en af de nemmeste polysaccharider at aktivere med CDAP på grund af sin relativt høje tæthed af hydroxylgrupper, men nogle polysaccharider, såsom Vi antigen, kan være udfordrende. Derfor er der ingen enkelt “bedste” protokol for CDAP bøjning direkte til proteiner. Vi foreslår først at udvikle en protokol for at opnå passende niveauer af aktivering, som bestemt af omfanget af hydrazid derivatization, og derefter fortsætter med at direkte protein bøjning til CDAP-aktiveret polysaccharid.
The authors have nothing to disclose.
Det arbejde, der er beskrevet her, blev finansieret af Fina Biosolutions LLC.
Acetonitrile | Sigma | 34851 | |
Adipic acid dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Amicon Ultra 15 10 kDa | Millipore | UFC901008 | MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS |
Analytical balance | |||
Autotitrator or electronic pipet | |||
Beaker 2-4 L | |||
CDAP | SAFC | RES1458C | Sigma |
DMAP | Sigma | 107700 | MW 122.2 |
Flake ice | |||
HCl 1 M | VWR | BDH7202-1 | |
Micro stir bar | VWR | 76001-878 | |
Microfuge tube (for CDAP) | VWR | 87003-294 | |
NaCl | VWR | BDH9286 | |
NaOH 1 M | Sigma | 1099130001 | |
NaOH 10 M | Sigma | SX0607N-6 | |
pH meter | |||
pH probe | Cole Parmer | 55510-22 | 6 mm x 110 mm Epoxy single junction |
pH temperature probe | |||
Pipets & tips | |||
Saline or PBS | |||
Small beaker 5-20 mL | VWR | 10754-696 | A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet |
Small ice bucket | |||
Small spatula | |||
Stir plate | |||
Resorcinol assay | |||
Combitip | Eppendorf | 10 ml | |
DI water | |||
Dialysis tubing | Repligen | 132650T | Spectra/Por 6-8kDa |
Dialysis tubing clips | Repligen | 142150 | |
Heating block | |||
Nitrile gloves | VWR | ||
Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
Resorcinol | Sigma | 398047 | |
Sugar standard | As appropriate | ||
Sulfuric acid 75% | VWR | BT126355-1L | |
Timer | |||
TNBS assay | |||
Adipic dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Borosilcate test tubes 12 x 75 | VWR | 47729-570 | |
Sodium borate, 0.5 M pH 9 | Boston Biologicals | BB-160 | |
TNBS 5% w/v | Sigma | P2297 | MW 293.17 |