प्रोटीन और अमीन युक्त लिगामेंट्स को सहसंयोजक प्रोटीन (लिगामेंट)-पॉलीसैकराइड कंजूगेट्स बनाने के लिए साइनिलेशन रिएजेंट, 1-साइनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट (सीडीएपी) द्वारा सक्रिय पॉलीसैकराइड्स से सहसंयोजक रूप से जोड़ा जा सकता है । यह लेख 0 डिग्री सेल्सियस पर नियंत्रित सीडीएपी सक्रियण और अलग-अलग पीएच और सक्रिय पॉलीसैकराइड्स के बाद के संविलियन को अंजाम देने के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
वैकसिनोलॉजी में कंजूगेट टीके उल्लेखनीय प्रगति हैं। पॉलीसैकराइड संजूबा टीकों की तैयारी के लिए, पॉलीसैकराइड्स को आसानी से कार्यात्मक किया जा सकता है और 1-साइनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरोबोरेट (सीडीएपी), एक आसान-से-हैंडल साइनिलेटिंग रिएजेंट का उपयोग करके वैक्सीन वाहक प्रोटीन से जोड़ा जा सकता है। सीडीएपी पीएच 7-9 पर कार्बोहाइड्रेट हाइड्रोक्सिल समूहों के साथ प्रतिक्रिया करके पॉलीसैकराइड्स को सक्रिय करता है। सीडीएपी की स्थिरता और प्रतिक्रियाशीलता अत्यधिक पीएच-निर्भर है। सीडीएपी के हाइड्रोलिसिस के कारण सक्रियण के दौरान प्रतिक्रिया का पीएच भी कम हो जाता है, जो अच्छा पीएच प्रजनन सक्रियण की कुंजी को नियंत्रित करता है। मूल सीडीएपी सक्रियण प्रोटोकॉल कमरे के तापमान पर बिना खरीदार पीएच 9 समाधानों में किया गया था।
इस स्थिति (<3 मिनट) के तहत तेजी से प्रतिक्रिया और तेजी से सीडीएपी हाइड्रोलिसिस से तेजी से पीएच ड्रॉप के कारण, कम समय सीमा में लक्ष्य प्रतिक्रिया पीएच को जल्दी से समायोजित और बनाए रखना चुनौतीपूर्ण था। यहां वर्णित बेहतर प्रोटोकॉल 0 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है, जो सीडीएपी हाइड्रोलिसिस को धीमा कर देता है और सक्रियण समय को 3 मिनट से ~ 15 मिनट तक बढ़ाता है। CDAP रिएजेंट जोड़ने से पहले लक्ष्य सक्रियण पीएच के पॉलीसैकराइड समाधान को पूर्व-समायोजित करने के लिए डिमेथाइलामिनोपाइरिडीन (डीएमएपी) का भी उपयोग बफर के रूप में किया गया था। लंबी प्रतिक्रिया समय, धीमी सीडीएपी हाइड्रोलिसिस और डीएमएपी बफर के उपयोग के साथ मिलकर, सक्रियण प्रक्रिया की पूरी अवधि के लिए सक्रियण पीएच को बनाए रखना आसान बनाता है। बेहतर प्रोटोकॉल सक्रियण प्रक्रिया को कम उन्मत्त, अधिक प्रजनन योग्य और स्केलिंग के लिए अधिक उत्तरदायी बनाता है।
वैकसिकोलॉजी1,2 में उल्लेखनीय प्रगति के बीच हैं, जैसे कि पॉलीसैकराइड से जुड़े टीकों, जैसे कि पॉलीसैकराइड्स से जुड़ेहुएहैं। पॉलीसैकराइड्स, टी-सेल-स्वतंत्र एंटीजन के रूप में, शिशुओं में खराब इम्यूनोजेनिक होते हैं और स्मृति, वर्ग स्विचिंग, या एंटीबॉडी3की आत्मीयता परिपक्वता को प्रेरित नहीं करते हैं। पॉलीसैकराइड संयोजित टीकों में इन कमियों को दूर किया जाता है4. चूंकि अधिकांश पॉलीसैकराइड्स में संवध के लिए एक सुविधाजनक रासायनिक हैंडल नहीं होता है, इसलिए उन्हें पहले प्रतिक्रियाशील या “सक्रिय” बनाया जाना चाहिए। सक्रिय पॉलीसैकराइड को तब सीधे प्रोटीन (या संशोधित प्रोटीन) से जोड़ा जाता है या संजीदशन 4 से पहले अतिरिक्त व्युत्पन्न के लिए कार्यात्मक कियाजाताहै। अधिकांश लाइसेंस प्राप्त पॉलीसैकराइड संयोजित टीके पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल को सक्रिय करने के लिए या तो अपचय अमीनेशन या साइनिलेशन का उपयोग करते हैं। सायनोजेन ब्रोमाइड (सीएनबीआर), एक अभिवात जिसका उपयोग पहले क्रोमेटोग्राफी रेजिन को सक्रिय करने के लिए किया गया था, का उपयोग शुरू में पॉलीसैकराइड व्युत्पन्नीकरण के लिए किया जाता था। हालांकि, सीएनबीआर को उच्च पीएच की आवश्यकता होती है, आमतौर पर ~ पीएच 10.5 या उससे अधिक, आंशिक रूप से पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल को विकृत करने के लिए ताकि वे साइनो समूह पर हमला करने के लिए पर्याप्त रूप से न्यूक्लियोफिलिक हों। उच्च पीएच आधार-लैबाइल पॉलीसैकराइड्स के लिए हानिकारक हो सकता है, और न तो सीएनबीआर और न ही सक्रिय साइनानो-एस्टर शुरू में गठित इस तरह के उच्च पीएच पर पर्याप्त रूप से स्थिर है।
सीडीएपी (1-साइनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट; चित्रा 1) 5,6के सक्रियण के लिए एक साइनिलेटिंग एजेंट केरूप में उपयोग के लिए Lees et al. द्वारा पेश किया गया था । CDAP, जो क्रिस्टलीय और संभालना आसान है, CNBr की तुलना में कम पीएच पर पॉलीसैकराइड्स को सक्रिय करने और कम साइड प्रतिक्रियाओं के साथ पाया गया। सीएनबीआर के विपरीत, सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड्स को संश्लेषण प्रक्रिया को सरल बनाते हुए प्रोटीन के लिए सीधे संयोजित किया जा सकता है। सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड्स को अमीनो-या हाइड्राइड-व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड बनाने के लिए डायमाइन (जैसे, हेक्सेन डायमाइन) या एक डाइहाइड्राजाइड (जैसे, एडिपिक डाइहाइड्राजाइड, एडीएच) के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है। पॉलीसैकराइड्स के क्रॉसलिंकिंग को दबाने के लिए होमोबियल रिएजेंट की उच्च एकाग्रता का उपयोग किया जाता है। अमीनो पॉलीसैकराइड्स को प्रोटीन संयुग्मण के लिए उपयोग की जाने वाली असंख्य तकनीकों में से किसी का उपयोग करके संयुग्मित किया जा सकता है। हाइड्राइड-व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड्स को अक्सर कार्बोडिमाइड रिएजेंट (जैसे, 1-एथिल-3-(3-डाइमेथाइलमिनोप्रोपिल) कार्बोडिमाइड (ईडीएसी)7का उपयोग करके प्रोटीन के साथ जोड़ा जाता है। सीडीएपी पॉलीसैकराइड एक्टिवेशन का इसके अलावा अनुकूलन Lees et al.8 द्वारा वर्णित किया गया है और यहां वर्णित प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है।
सीडीएपी संयोजीय अवलोकन
सीडीएपी प्रोटोकॉल को दो चरणों के रूप में अवधारणा किया जा सकता है: (1) पॉलीसैकराइड की सक्रियता और (2) प्रोटीन या लिगामेंट(चित्र 2)के साथ सक्रिय पॉलीसैकराइड का संविलियन। पहले चरण का लक्ष्य पॉलीसैकराइड को कुशलतापूर्वक सक्रिय करना है, जबकि दूसरे का लक्ष्य सक्रिय पॉलीसैकराइड को कुशलतापूर्वक संयोजित करना है। सक्रिय पॉलीसैकराइड दोनों चरणों को एक साथ जोड़ता है। यह अवधारणा प्रत्येक चरण के महत्वपूर्ण तत्वों पर ध्यान केंद्रित करने में मदद करती है। चित्रा 2 इस अवधारणा पर फैलता है, जिसमें हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रियाओं और साइड प्रतिक्रियाओं के साथ वांछित सक्रियण और युग्मन प्रतिक्रियाएं दिखाई देती हैं।
सक्रियण चरण के दौरान, तीन प्रमुख चिंताएं सीडीएपी स्थिरता, पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल के साथ सीडीएपी प्रतिक्रिया, और सक्रिय पॉलीसैकराइड(चित्रा 3)की स्थिरता हैं। पीएच के साथ सीडीएपी हाइड्रोलिसिस बढ़ जाता है, जैसा कि सक्रिय पॉलीसैकराइड और साइड प्रतिक्रियाओं का हाइड्रोलिसिस है। हालांकि, पीएच बढ़ाने से पॉलीसैकराइड के साथ सीडीएपी रिएक्शन की सुविधा है। सीडीएपी के साथ पॉलीसैकराइड को कुशलतापूर्वक सक्रिय करने के लिए पॉलीसैकराइड और सीडीएपी और 2 की प्रतिक्रियाशीलता के बीच संतुलन की आवश्यकता होती है) रिएजेंट और सक्रिय पॉलीसैकराइड दोनों की हाइड्रोलिसिस और साइड प्रतिक्रियाएं।
लीस एट अल द्वारा वर्णित मूल सीडीएपी सक्रियण प्रोटोकॉलमें,पॉलीसैकराइड्स की सीडीएपी सक्रियण बिना खरीदार पीएच 9 समाधान में कमरे के तापमान पर किया गया था। इस स्थिति के तहत सक्रियण की दर तेजी से पाई गई, और सक्रियण 3 मिनट के भीतर पूरा हो जाएगा। प्रतिक्रिया भी CDAP के तेजी से हाइड्रोलिसिस के साथ था, unbuffered प्रतिक्रिया समाधान की एक तेजी से पीएच ड्रॉप के कारण । इतनी कम समय सीमा में लक्ष्य मूल्य पर प्रतिक्रिया पीएच को जल्दी से उठाना और बनाए रखना चुनौतीपूर्ण था। वर्णित प्रोटोकॉल में, 100 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान से बिना बड़े पॉलीसैकराइड समाधान के लिए सीडीएपी जोड़कर सक्रियण किया गया था। पीएच को 30 एस बाद में “0.2 एम ट्राइथिलमाइन की बराबर मात्रा” के साथ उठाया गया था। प्रोटीन को संयुग्मित किया जाना था, फिर सक्रियण प्रतिक्रिया में 2.5 मिनट के बाद जोड़ा गया था। विशेष रूप से, सक्रियण कदम का पीएच अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं था और सबसे अधिक संभावना शुरू में लक्ष्य पीएच से अधिक थी। त्वरित पीएच समायोजन की आवश्यकता वाली तेज प्रतिक्रिया ने सक्रियण प्रक्रिया को नियंत्रित करने और बड़े पैमाने पर चुनौतीपूर्ण बना दिया।
मूल प्रोटोकॉल के विपरीत, यहां वर्णित संशोधित प्रोटोकॉल में दो प्रमुख सुधार हैं। सबसे पहले, पॉलीसैकराइड समाधान का पीएच सीडएपी के अलावा, बफर के रूप में डीएमएपी का उपयोग करके सक्रियण पीएच को लक्षित करने के लिए पूर्व-समायोजित किया जाता है। DMAP 9.5 का एक पीसीए है और इस तरह पीएच 9 के आसपास अच्छी बफरिंग शक्ति है, और कई अन्य बफ़र्स के विपरीत, DMAP CDAP हाइड्रोलिसिस8को बढ़ावा देने के लिए नहीं पाया गया था। इसके अलावा, डीएमएपी पहले से ही एक प्रक्रिया मध्यवर्ती है और इसलिए प्रतिक्रिया मिश्रण में एक नया घटक नहीं जोड़ता है। सीडीएपी जोड़ने से पहले पीएच को पूर्व-समायोजित करना प्रतिक्रिया की शुरुआत में बड़े पीएच स्विंग को समाप्त करता है और प्रतिक्रिया के दौरान लक्ष्य पीएच के अधिक कुशल रखरखाव की अनुमति देता है। दूसरा सुधार 0 डिग्री सेल्सियस पर सक्रियण प्रतिक्रिया करना है, जहां सीडीएपी हाइड्रोलिसिस की दर कमरे के तापमान की तुलना में स्पष्ट रूप से धीमी है। 0 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक अभिकर्ण आधा जीवन के साथ, कम तापमान पर धीमी सक्रियण दर की भरपाई के लिए सक्रियण समय 3 मिनट से बढ़कर 15 मिनट हो जाता है। अब प्रतिक्रिया समय, बदले में, प्रतिक्रिया पीएच को बनाए रखना आसान बनाता है। 0 डिग्री सेल्सियस का उपयोग पीएच-संवेदनशील पॉलीसैकराइड्स के क्षरण को भी धीमा कर देता है, जिससे इस प्रकार के पॉलीसैकराइड के संजूगेट तैयार करना संभव हो जाता है। प्रोटोकॉल में सुधार सक्रियण प्रक्रिया को कम उन्मत्त, नियंत्रित करने में आसान, अधिक प्रजनन योग्य और स्केलिंग के लिए अधिक उत्तरदायी बनाते हैं।
यह लेख 0 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीसैकराइड के नियंत्रित सीडीएपी सक्रियण और एक निर्दिष्ट लक्ष्य पीएच पर और एडीएच के साथ सक्रिय पॉलीसैकराइड के बाद के व्युत्पन्न प्रदर्शन के लिए बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इसके अलावा वर्णित एक त्रिनीट्रोबेनजेन सल्फोनिक एसिड (TNBS) परख, क्यूई एट अल9की विधि के आधार पर, संशोधित पॉलीसैकराइड पर हाइड्राजाइड स्तर के निर्धारण के लिए है। रेसोरसिनॉल और सल्फ्यूरिक एसिड10 पर आधारित हेक्सोस के लिए एक संशोधित परख भी वर्णित है, जिसका उपयोग पॉलीसैकराइड्स की व्यापक श्रृंखला निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। सीडीएपी सक्रियण और संयोजण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पाठक को पहले के प्रकाशनों5,6, 8को लीस एट अल द्वारा संदर्भित कियाजाता है।
सीडीएपी पॉलीसैकराइड्स को प्राप्त करने और संयोजित करने के लिए एक सुविधाजनक अभिकर्षक है। यह लेख हाइड्राज़ाइड (पीएस-एडीएच) के साथ पॉलीसैकराइड्स को प्राप्त करने के लिए सीडीएपी का उपयोग करने की सामान्य विधि का वर्णन करता है और हाल ही में प्रकाशित सुधार8को शामिल करता है। सबसे पहले, तकनीक सक्रियण प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए लक्ष्य पीएच को बनाए रखने के महत्व पर जोर देती है। हमने पाया कि जबकि कई आम बफ़र्स सीडीएपी सक्रियण प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करते हैं, डीएमएपी को पीएच8का प्रबंधन करने के लिए बफर के रूप में सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, डीएमएपी पहले से ही सीडीएपी सक्रियण का एक प्रतिक्रिया प्रतिफल है। अंत में, सीडीएपी को जोड़ने से पहले डीएमएपी के साथ पॉलीसैकराइड समाधान बफरिंग प्रतिक्रिया पीएच के सटीक लक्ष्यीकरण और रखरखाव की सुविधा प्रदान करता है। जैसा कि हम वर्णन करते हैं, केंद्रित डीएमएपी स्टॉक समाधान के पीएच को समायोजित करना उपयोगी है जैसे कि पतला होने पर, यह लक्षित पीएच तक पहुंचता है। दूसरे, ठंड में प्रक्रिया का प्रदर्शन प्रतिक्रिया समय धीमा, सक्रियण प्रक्रिया कम उंमत्त और अधिक क्षमा कर रही है । कम तापमान सीडीएपी हाइड्रोलिसिस की दर में कमी आई, और पीएच 9 पर इष्टतम सक्रियण समय ~ 3 मिनट से ~ 15 मिनट तक बढ़ जाता है। इसके अलावा, कमरे के तापमान पर प्रदर्शन की तुलना में सक्रियण के समान स्तर को प्राप्त करने के लिए कम सीडीएपी की आवश्यकता होती है।
एडीएच-व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड्स को कार्बोडिमाइड्स (जैसे, EDAC)7का उपयोग करके प्रोटीन के लिए संयोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कई लाइसेंस प्राप्त हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा बी (हिब) टीके एडीएच के साथ प्राप्त पॉलीरिबाइल्रिबिटोल्फॉस्फेट (पीआरपी) का उपयोग करते हैं ताकि EDAC का उपयोग करके टेटनस टॉक्सोइड को संयोजित किया जा सके। CNBr शुरू में कार्यरत था, लेकिन CDAP इस उद्देश्य के लिए उपयोग करने के लिए एक बहुत आसान अभिकर् ता है। हमारे अनुभव में, एडीएच व्युत्पन्नीकरण के लिए एक अच्छा लक्ष्य सीमा प्रति 100 केडीए पॉलीसैकराइड या वजन के अनुसार ~ 1-3% एडीएच 10-30 हाइड्राज़ाइड है।
इसी प्रक्रिया का उपयोग डायमिन के लिए एडीएच को प्रतिस्थापन करके प्राथमिक अमीनों के साथ पॉलीसैकराइड्स को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। 8 अमीनों के साथ पॉलीसैकराइड्स प्राप्त करने केलिए हेक्साने डाइमाइन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। अमीनेटेड पॉलीसैकराइड (पीएस-एनएच2)को प्रोटीन संयुग्मण11के लिए विकसित अभिजेंट्स का उपयोग करके संयुग्मित किया जा सकता है। आमतौर पर, पीएस-एनएच2 एक मालेमाइड (उदाहरण के लिए, succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] साइक्लोहेक्साने-1-कार्बोक्सिलेट (एसएमसीसी) या एन-γ-मालेमिडोबुटिलिल-ऑक्सीस्यूसिनिमाइड एस्टर (जीएमबीएस)), और प्रोटीन थिओलेटेड (जैसे, succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) प्रोपेलेट (एसपीडीपी) के साथ) है । थिओल-मलीमाइड केमिस्ट्री बहुत कुशल है।
प्रोटीन को सीधे ɛ-अमीन ऑन lysines के माध्यम से सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड्स में भी जोड़ा जा सकता है। जबकि सक्रियण प्रोटोकॉल का उपयोग आम तौर पर यहां वर्णित एक के समान होता है, सक्रियण, पॉलीसैकराइड और प्रोटीन एकाग्रता के स्तर के साथ-साथ प्रोटीन: पॉलीसैकराइड अनुपात5,6,8को अनुकूलित करना आवश्यक है।
डेक्सट्रान हाइड्रोक्सिल समूहों के अपेक्षाकृत उच्च घनत्व के कारण सीडीएपी के साथ सक्रिय करने के लिए सबसे आसान पॉलीसैकराइड्स में से एक है, लेकिन Vi एंटीजन जैसे कुछ पॉलीसैकराइड चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। नतीजतन, प्रोटीन के लिए सीधे सीडीएपी संयोजित करने के लिए कोई “सर्वश्रेष्ठ” प्रोटोकॉल नहीं है। हम पहले सक्रियण के उपयुक्त स्तरों को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने का सुझाव देते हैं, जैसा कि हाइड्राज़ाइड व्युत्पन्न की सीमा तक निर्धारित होता है, और फिर सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड को सीधे प्रोटीन संग्राम करने के लिए आगे बढ़ना।
The authors have nothing to disclose.
यहां वर्णित कार्य को फिना बायोसॉल्यूशंस एलएलसी द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Acetonitrile | Sigma | 34851 | |
Adipic acid dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Amicon Ultra 15 10 kDa | Millipore | UFC901008 | MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS |
Analytical balance | |||
Autotitrator or electronic pipet | |||
Beaker 2-4 L | |||
CDAP | SAFC | RES1458C | Sigma |
DMAP | Sigma | 107700 | MW 122.2 |
Flake ice | |||
HCl 1 M | VWR | BDH7202-1 | |
Micro stir bar | VWR | 76001-878 | |
Microfuge tube (for CDAP) | VWR | 87003-294 | |
NaCl | VWR | BDH9286 | |
NaOH 1 M | Sigma | 1099130001 | |
NaOH 10 M | Sigma | SX0607N-6 | |
pH meter | |||
pH probe | Cole Parmer | 55510-22 | 6 mm x 110 mm Epoxy single junction |
pH temperature probe | |||
Pipets & tips | |||
Saline or PBS | |||
Small beaker 5-20 mL | VWR | 10754-696 | A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet |
Small ice bucket | |||
Small spatula | |||
Stir plate | |||
Resorcinol assay | |||
Combitip | Eppendorf | 10 ml | |
DI water | |||
Dialysis tubing | Repligen | 132650T | Spectra/Por 6-8kDa |
Dialysis tubing clips | Repligen | 142150 | |
Heating block | |||
Nitrile gloves | VWR | ||
Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
Resorcinol | Sigma | 398047 | |
Sugar standard | As appropriate | ||
Sulfuric acid 75% | VWR | BT126355-1L | |
Timer | |||
TNBS assay | |||
Adipic dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Borosilcate test tubes 12 x 75 | VWR | 47729-570 | |
Sodium borate, 0.5 M pH 9 | Boston Biologicals | BB-160 | |
TNBS 5% w/v | Sigma | P2297 | MW 293.17 |