Vi leverer en protokol til vurdering af motorisk adfærd via et adfærdsmæssigt testbatteri hos rotter efter iskiasnerven knuse skade.
Induktion af en perifer nerveskade er en udbredt metode i neurovidenskab til vurdering af reparations- og smertemekanismer blandt andre. Derudover har iskias crush skade på forskningsområdet bevægelsesforstyrrelser været ansat til at udløse en dystonilignende fænotype i genetisk disponerede DYT-TOR1A gnavermodeller af dystoni. For at opnå konsekvente, reproducerbare og sammenlignelige resultater efter en iskiasnerve knuse skade, en standardiseret metode til at fremkalde nerve crush er afgørende, ud over en standardiseret fænotypisk karakterisering. Der skal ikke kun lægges vægt på det specifikke udvalg af adfærdstest, men også på de tekniske krav, den korrekte udførelse og fortløbende dataanalyse. Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan man udfører en iskiasnerve knuse skade og giver en adfærdsmæssig test batteri til vurdering af motoriske underskud hos rotter, der omfatter det åbne felt test, CatWalk XT gangart analyse, strålen gå opgave, og stigen tringen gå opgave.
Gnavere er fremragende modelorganismer til at uddybe forståelsen af menneskelige sygdomme1,2 ved at teste hypoteser på flere biologiske niveauer. Et grundlæggende biologisk niveau for karakterisering af gnavermodeller er fænotypeniveauet målt ved adfærdsmæssige vurderinger. Afhængigt af dyremodellen og det videnskabelige forskningsspørgsmål er udvælgelsen af et kraftfuldt og pålideligt adfærdstestbatteri afgørende for at dække en bred vifte af adfærdsmæssige aspekter som for dyremodeller af Parkinsons sygdom og dystoni3,4,5,6.
Iskiasnerven er den største nerve i menneskekroppen med motoriske såvel som sensoriske fibre. Skader på iskiasnerven kan let skyldes en række begivenheder såsom trafikulykker og operationer7,8. Derfor er forskningsaktiviteter ved hjælp af gnavermodeller med iskiasnerveskader af translationelt relevant værdi. Selv om translationelle aspekt af nerve regenerering fra rotte til menneske skal betragtes kritisk9, iskiasnerven knuse skade (axonotmesis) i gnaver modeller er en almindeligt anvendt metode til at analysere degeneration og regenerering processer perifere nerver10,11. I tilfælde af en knuse skade nerven er ikke helt transected. Det beskadiger axonen, hvilket resulterer i ledningsblok direkte efter knusningsskade efterfulgt af regenerative processer 4,12,13.
Desuden, i dystoni forskning, den ensidige iskiasnerven knuse skade er en etableret metode til at udløse dystoni-lignende bevægelser (DLM) i genetisk disponerede dystoni gnaver modeller, som ikke viser DLM i sig selv4,14. Det antages, at det perifere nervetraume forstyrrer den sensorimotoriske integration ved at påvirke iskiasnervenfibrene, som er ansvarlige for motoriske og sensoriske funktioner15.
Vi giver her en detaljeret beskrivelse af en standardiseret knuse skade af iskiasnerven og et batteri af motoriske adfærd vurderinger, der er sammensat af det åbne felt test (OFT), CatWalk XT gangart analyse, stråle gå opgave og stigen trin gå opgave i naive vilde type (wt) rotter (n = 8-9) og wt rotter fem uger efter ensidig iskiasnerven knuse skade (n = 10). OFT giver information om den generelle lokomotoriske aktivitet, mens en detaljeret ganganalyse opnås ved hjælp af det automatiserede ganganalysesystem CatWalk XT. Bjælkevandringsopgaven bruges til at vurdere motorkoordinationen ved at evaluere tiden til at krydse strålen og antallet af fodplaceringsfejl. Til ganggenoptrædensanalyse giver stigen trinvandringsopgaven oplysninger om fod- eller poteplacering og fejl på et vandret stige rungapparat med et konstant, men uregelmæssigt trinmønster.
Denne adfærdsmæssige vurdering protokol giver et overblik over fordele og ulemper samt mulige udlæsninger af den valgte adfærdsmæssige test batteri i en gnaver model efter iskiasnerven knuse skade.
For at opnå et komparativt resultat af iskiasnerven knuse skade, en konsekvent knuse teknik er obligatorisk. Brugen af en ikke-savtakket klemme (Ultra Fine Hemostat) i stedet for pincet kan forbedre konsistensen af knusningen. Brug den samme klemme samt den samme knuseposition for at sikre lige nervekompression. Den eksklusive brug af klemmen til knusningsskade og håndtering af klemmen med omhu forbedrer konsistensen. Udfør også proceduren for knuseskaden med omhu. Yderligere skader på nerven under operationen, såsom uønsket trækkraft af nerven kan føre til uønskede bivirkninger som automutilation. Derfor anbefales en omhyggelig nerveforberedelse samt administration af en smertestillende middel i mindst to dage.
Multifaktoriel vurdering af motorisk adfærd kan karakterisere fænotypen efter nerveknusningsskade hos rotter på forskellige niveauer. Vi brugte OFT, CatWalk XT gangart analyse, stråle gå opgave og stigen trin gå opgave. En blindet eksperimentel procedure og dataanalyse til eksperimentelle grupper er afgørende for disse eksperimenter. Før adfærdsvurdering blev dyrene akklimateret i testlokalet under testbetingelser i mindst 30 minutter. Alle de adfærdsmæssige tests, der anvendes heri, har den fordel, at mad eller vandmangel ikke er påkrævet. Det samme gruppesæt af dyr blev brugt i alle beskrevne adfærdstest. Der blev udført højst to forskellige adfærdstest om dagen for hvert dyr. Hvis adfærdstest udføres med jævne mellemrum, skal du være opmærksom på en sammenlignelig procedure, som at udføre testen i samme dyreordre og på samme tidspunkt af dagen. Et andet vigtigt aspekt for adfærdsanalyse er rotternes dag-nat cyklus. Overvej en omvendt dag-nat cyklus for at opnå mere naturlige og højere aktivitetsniveauer på dagen cyklus (mørk cyklus). Dette skal især overvejes til måling af spontan adfærd, som OFT. I dette eksperiment kunne der ikke gennemføres en omvendt dag-nat cyklus, men der blev sikret en passende akklimatisering af testbetingelserne. En perfekt belysning er afgørende for videoer i høj opløsning til strålevandringsopgaven og stigen tringangsopgaven. Denne høje videokvalitet kan ikke nås, når du udfører eksperimenter i mørke.
Vurderingen af gangart kræver en kontinuerlig opgaveydelse. Det første vigtige aspekt af en kontinuerlig opgaveydelse er at overbevise dyrene om at krydse opsætningen. For at øge motivationen skal du placere små fødevarepiller (45 mg) i slutningen af opsætningen. For at dyrene kan blive fortrolige med fødevarepillerne, skal pellets fodres med dem inden testning. Det kan også være nyttigt med en målboks i slutningen af opsætningen. Opsætningen af CatWalk indeholder allerede en målboks, men rotter tøver nogle gange med at komme ind i målboksen. Alternativt kan du tilføje et lille bur i målboksen, men hjemmeburet fra rotter passer ikke ind i målboksen. Lad rotten vænne sig i buret i et par minutter før erhvervelsen. Derudover kan en anden rotte fra samme hjemmebur placeres i målboksen eller i buret inde i målboksen. Sørg for, at den anden rotte forbliver i kassen og ikke blokerer indgangen til målboksen. Desuden er det også muligt at fjerne målboksen fra CatWalk-systemet og placere rottens hjemmebur i slutningen af gangbroen, hvilket gør det muligt for rotten at komme ind i deres “hjemmeområde” efter hvert løb. Til opsætning af bjælkevandringsopgaven og stigen trinvandringsopgave anbefaler vi at tilføje en målboks eller hjemmeburet i slutningen af opsætningen. For at sikre konsistens skal CatWalk, bjælkevandringsopgaven og stigen rung walking-opgaven udføres mindst en gang om ugen med seks til ti kørsler.
Selvom ikke alle analyser gav betydelige forskelle i denne undersøgelse, mener, at en optagelse af genetisk modificerede dyr eller behandlingsgrupper kunne producere værdifulde data, der kan skelne mellem grupper fra de samme adfærdsmæssige tests.
Nerveknusningsskaden havde ingen effekt på rottens lokomotoriske aktivitet, som blev målt i en fem minutters OFT. Catwalk XT gangart analyse er et mere objektivt og følsomt værktøj til at analysere gangart, pote og tå placering. Efter en intensiv træning lærer rotterne at krydse gangbroen på CatWalk XT-apparatet til standardindstillingerne. Nerveskaden reducerer ikke rotternes evne til at krydse gangbroen. Den automatiske beregning af forskellige parametre præsenterer dataene objektivt. Yderligere oplysninger kan opnås ved hjælp af modulet “Interactive Footprint Measurements”, og disse analyser gav faktisk betydelige forskelle i forskellige parametre for tåspredning, printlængde og potevinkel til kropsakse, der sammenlignede rotter med og uden nerveskader.
Rotter kan trænes let til bjælkevandringsopgaven. Forskelle i latenstid for at krydse strålen og i antallet af fodslip pr. trin i den nerveskadede baglimb blev opdaget ved at sammenligne naiv med knuseskadede rotter. En ulempe ved at analysere nerveskadede rotter med bjælkevandringsopgaven er størrelsen af strålen. Inden for de første to uger efter iskiasnerven knuse skade, rotterne har brug for hjælp til at krydse strålen som deres balance er svækket. Selvom nogle rotter kan være i stand til at krydse strålen, er risikoen for skader forårsaget af et fald høj. Nerveknusede dyr bør derfor hjælpes med at krydse strålen i de første to uger efter iskiasnerven knuse skade eller længere, hvis det er nødvendigt. Det er dog vanskeligt at sammenligne kørsler med og uden hjælp. Motorbalancen er også en vigtig parameter vurderet af bjælkevandringsopgaven. Vi anså denne parameter for ikke at være relevant for vores nerveknusningsrottermodel. Derfor kunne scores beskrevet af Ohwatashi et al. og Johansson &Ohlsson ikke bruges og kører med en ufuldstændig stråle traverse blev udelukket for dataanalyse18,19.
Den 7-kategori skala fra Metz et al. kan analysere både for- og bagben og skelne mellem forskellige sværhedsgrad niveauer af fejl i alle lemmer under stigen trin gang opgave16,17. Ved at analysere de mest fremtrædende fejl, som omfatter kategorierne fra 0 til 2, kunne der ikke påvises forskelle i fejl pr. Trin i baglimb, når man sammenligner nerveskadede wt rotter med naive wt rotter. Desuden var latenstid for gennemkører stigen trin apparat ikke adskiller sig mellem nerve-skadede wt rotter og wt naive rotter. Deep learning modeller kunne forbedre og fremskynde dataanalyse af stigen trin trin gå opgave gennem en automatiseret tilgang.
Det er vigtigt at nævne, at nerveknusningsskaden såvel som alle beskrevne adfærdstest let kan oversættes til mus ved at tilpasse indstillingerne og størrelserne for opsætningerne. Brugen af mus som modelorganisme har den gavnlige virkning, at der findes transgene modeller for mange menneskelige sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF DysTract til C.W.I.) og af det tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) ved universitetet i Würzburg (N-362 til C.W.I.; Z2-CSP3 til L.R.). Derudover har dette projekt modtaget støtte fra EU’s Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under EJP RD COFUND-EJP Nr. 825575 (EurDyscover til J.V.) og fra VERUM Foundation. Desuden er C.W.I. finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Reseach Foundation) Project-ID 424778381-TRR 295 af Deutsche Stiftung Neurologie og ParkinsonFonds. L.R. støttes desuden af Dystonia Medical Reseach Foundation.
Forfatterne takker Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel og Louisa Frieß for deres tekniske bistand samt Helga Brünner for dyrepleje.
Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
Beam | self made | ||
Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
Box for OFT | self made | ||
Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Dumont #2 – laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
Heating table | MEDAX | 13801 | |
Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
Kinovea | www.kinovea.org | ||
Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
Octeniderm | Schülke | 118211 | |
Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
Rubber band retractors | self made | ||
Spacer for beam | self made | ||
Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |