Denne protokol indeholder trin fra DNA-ekstraktion til eksperimentel opsætning til digital dråbe PCR (ddPCR), herunder analyse til identifikation og kvantificering af ikke-homologe slut-sammenføjning (NHEJ) begivenheder på målsteder efter gRNA-induceret Cas9 kavalergang og DNA-reparation. Andre anvendelser af denne metode omfatter applikationer såsom polymorfi afsløring og gen-redigering variant verifikation.
De seneste fremskridt inden for myggegenom og genteknologi har skabt et behov for hurtige og effektive metoder til påvisning af målrettet DNA-sekvensvariation i stor skala. Specifikt er det vigtigt at registrere indsættelser og sletninger (indels) på gen-redigerede websteder, der er genereret af CRISPR-guide RNA (gRNA)/Cas9-medieret ikke-homolog end-joining (NHEJ), for at vurdere mytageneseens troskab og hyppigheden af utilsigtede ændringer. Vi beskriver her en protokol for digital-droplet PCR (ddPCR), der er velegnet til høj-throughput NHEJ analyse. Selvom denne metode ikke producerer data, der identificerer individuel sekvensvariation, giver den et kvantitativt skøn over sekvensvariationen i en population. Derudover kan denne protokol med passende ressourcer implementeres i en felt-site laboratorieindstilling lettere end næste generation eller Sanger sekventering. ddPCR har også en hurtigere turn-around tid til resultater end nogen af disse metoder, hvilket giver mulighed for en hurtigere og mere komplet analyse af genetisk variation i vilde populationer under feltforsøg med genetisk manipulerede organismer.
Gendrev har et enormt potentiale til at kontrollere insektpopulationer af medicinsk og landbrugsmæssig relevans1,2,3,4,5. For eksempel kan gendrevssystemer baseret på CRISPR Cas-nukleaser og guide RNA’er (gRNAs) bruges til at ændre vektormyggepopulationer ved at introducere træk, der giver ildfasthed til malariaparasitter, der fører til reduceret transmission og mindre sygdom1,4,5. Gendrevssystemet kopierer sig selv og det tilhørende træk fra et homologt kromosom til et andet i de præ-meiotiske kimceller, og dette sikrer, at størstedelen af afkomene arver drevet og skaber potentialet for langvarig og bæredygtig befolkningsændring i marken. En ulempe ved de Cas/gRNA-baserede metoder er imidlertid muligheden for at generere indsættelses- og sletningsmutationer (indel) mutationer gennem ikke-homologe end-joinerende (NHEJ) DNA-reparation, hvilket resulterer i generering af drevresistente alleler, som, når de akkumuleres til en høj nok frekvens i befolkningen, kan stoppe drevsystemet i at sprede1,2,3,4 . Denne protokol beskriver en højgennemsigtet og pålidelig metode, der kan bestemme forekomsten og den relative mængde indelmutationer, både på befolkningsniveau og individuelt niveau, under Cas /gRNA-baseret gendrev.
Næste generations sekventeringsmetoder (NGS) giver en løsning uden sidestykke. De omkostninger og tekniske krav , der er forbundet med NGS, forbyder imidlertid rutinemæssig afprøvning og begrænser brugen af den som en metode med høj gennemløb til vurdering af indels6,7,8. Traditionelle PCR-kvantificeringsmetoder har længe været anvendt som standardevalueringsprocedure for genomindels; Disse metoder er imidlertid arbejdskrævende, tager lang tid at skaffe data og har en høj grad af variation. Digital-Droplet PCR (ddPCR) har vist sig at være mere følsomme over for at opdage mutationer end Sanger sekventering i nogle applikationer og har en lavere detektionsgrænse end NGS i andre6,7,8,9. Desuden er omkostningerne til at vurdere et prøvesæt og turn-around-tid for at opnå resultater henholdsvis billigere og hurtigere for ddPCR end enten Sanger sekventering eller NGS9. Ved hjælp af et dual-probe-system identificerer Drop-Off-analysen NHEJ-alleler baseret på fraværet af WT-sekvens (wild-type) på det gRNA-ledede mål Cas9-cut site. I denne analyse forstærkes en kort amplicon, herunder det forventede udskårne sted for det Cas/gRNA-baserede system, med et bestemt primerpar. En fluorescerende sonde er designet til at binde sig til en bevaret region af amplicon og en anden fluorescerende sonde genkender WT sekvens af cut site. I nærværelse af en NHEJ-allel vil sidstnævnte ikke binde sig til ampliconen.
Brugen af ddPCR giver mulighed for at designe primere til at målrette sletninger, enkelt base-par forskelle og indsættelser, som vil give mulighed for NHEJ profilering i myg befolkning analyser9. I betragtning af disse attraktive funktioner skabte vi en protokol til ddPCR til højgennemsigtet påvisning af indels genereret fra et Cas / gRNA-baseret gendrevsystem i myg.
Digital-droplet PCR er en effektiv metode til at bestemme tilstedeværelsen af indel alleler som følge af NHEJ begivenheder i en Cas / gRNA-baseret gen-drev system og giver mulighed for kvantificering af hyppigheden af disse alleler hos enkeltpersoner eller befolkninger. Nogle trin i protokollen skal følges med særlig omhu for at opnå pålidelige resultater. For det første skal den genomiske DNA-ekstraktion udføres omhyggeligt for at sikre høj kvalitet og tilstrækkelig mængde. En god ekstraktion vil tillade nøjagtig bestemmelse af haploid genom kopier pr reaktion. Det er vores erfaring, at et kommercielt tilgængeligt sæt (se Materialetabel)konsekvent leverede DNA-ekstraktioner af høj kvalitet. Ekstraktioner af individuelle myg kan dog vise sig at være særligt udfordrende, da DNA-pellet bliver svært at visualisere og let kan suges op med supernatanten, hvis den ikke passer på. For det andet skal primere og sonder udformes omhyggeligt. Før ddPCR-eksperimentet er afsluttet, skal du sikre dig, at de designede primere resulterer i et enkelt PCR-produkt ved først at udføre en traditionel PCR og visualisere et enkelt produkt via gelelektroforese. Reference FAM sonden skal også være konstrueret således, at den supplerer en meget bevaret sekvens. Dette vil sikre nøjagtige opdagelser af WT alleler i hele en forskelligartet befolkning. Primer/sondekombinationerne for hvert unikt eksperiment vil have forskellige termocykelforhold, og det anbefales at optimere disse forhold ved hjælp af en termisk gradient.
Der findes andre metoder til identifikation af indels, f.eks. Sanger sekventering er begrænset, fordi det har en lavere grænse for detektion og lav opdagelse magt til at identificere nye varianter. Sanger sekventering er også arbejdskrævende og er ikke høj-throughput. Sammenlignet med Sanger sekventering, NGS ikke har de samme begrænsninger af lav følsomhed, opdagelse magt, og gennemløb. En anden fordel ved NGS er dens evne til at opdage en række mutationer fra enkelt nukleotidpolymorfi (SNPs) til omlægninger. NGS er imidlertid en dyrere og tidskrævende metode til at bestemme Cas9/gRNA-associerede indels, fordi der kun er en målregion af interesse, og den er bedst egnet til større genom-dækkende analyser. Sammenlignet med de ovennævnte metoder er ddPCR høj gennemløb og har en hurtig turn-around tid. Hvis ddPCR materialer og instrumenter er tilgængelige in-house, 96 prøver kan behandles inden for 1-2 dage, hvilket gør det velegnet til hurtig analyse af store forsøg med Cas9/gRNA-modificerede organismer.
Mens mange fordele findes for ddPCR der er også begrænsninger. For det første er ddPCR-udstyret ikke hyppigt tilgængeligt i et uafhængigt laboratoriemiljø. ddPCR-udstyr kan være tilgængeligt i fællesskab på større forskningsinstitutioner, men dette giver ikke mulighed for nem datagenerering og -analyse uden for institutionen. For det andet giver ddPCR i modsætning til alternativerne ikke de individuelle unikke sekvenser af identificerede indelmutationer. Digital-droplet PCR vil give hyppigheden af indel mutationer i en population, men uden sekvensen, kan man ikke afgøre, om de foreliggende indels er mere tilbøjelige til at bevare eller hæmme funktionen af genet af interesse. DDPCR-metoden er måske bedst egnet til at analysere vilde populationer efter et feltfrigivelsesforsøg af en Cas9 /gRNA-baseret drevorganisme, fordi den effektivt kan bestemme hyppigheden af indførelsen af transgene i den indfødte befolkning og dannelsen af indels i befolkningen i tæt på realtid. På grund af ddPCR hurtig turn-around tid, ville det være muligt at udføre prøveudtagning og analysere befolkningen i et felt forsøg region ugentligt, hvis materialer var tilgængelige lokalt. Opstartsomkostningerne for køb, import og oprettelse af ddPCR-udstyret vil være høje i fjerntliggende laboratorier, men fordelene ved at kunne vurdere en streng vild befolkning, da den er under forandring fra et drevsystem, ville retfærdiggøre omkostningerne.
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen blev ydet af University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ er donald Bren professor ved University of California, Irvine.
Reagents | |||
ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
Materials | |||
ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
Equipment | |||
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |