Digital-Droplet PCR för att upptäcka indelsmutationer i genetiskt modifierade anofenin myggpopulationer

Summary

Detta protokoll ger steg från DNA-extraktion till experimentell uppsättning för digital dropp PCR (ddPCR), inklusive analys för identifiering och kvantifiering av icke-homologa end-joining (NHEJ) händelser på målplatser efter gRNA-inducerad Cas9 klyvning och DNA-reparation. Andra användningsområden för denna metod inkluderar applikationer som polymorfismdetektering och genredigeringsvariantverifiering.

Abstract

De senaste framstegen inom mygggenomik och genteknik har främjat ett behov av snabba och effektiva metoder för att upptäcka riktad DNA-sekvensvariation i stor skala. Specifikt är det viktigt att upptäcka infogningar och borttagningar (indels) på genredigerade platser som genereras av CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-medierad icke-homolog end-joining (NHEJ) för att bedöma mutagenes trohet och frekvensen av oavsiktliga förändringar. Vi beskriver här ett protokoll för digital-droplet PCR (ddPCR) som är väl lämpad för NHEJ-analys med hög genomströmning. Även om den här metoden inte producerar data som identifierar individuell sekvensvariation, ger den en kvantitativ uppskattning av sekvensvariationen inom en population. Dessutom, med lämpliga resurser, kan detta protokoll implementeras i en fält-plats laboratorie inställning lättare än nästa generations eller Sanger sekvensering. ddPCR har också en snabbare vändningstid för resultat än någon av dessa metoder, vilket möjliggör en snabbare och mer fullständig analys av genetisk variation i vilda populationer under fältförsök av genetiskt modifierade organismer.

Introduction

Gendrivare har en enorm potential att kontrollera insektspopulationer av medicinsk och jordbruksrelevans^1,2,3,4,5. Till exempel kan gendrivna system baserade på CRISPR Cas nukleaser och guide RNAs (gRNAs) användas för att modifiera vektormyggpopulationer genom att införa egenskaper som ger refraktoritet till malariaparasiter vilket leder till minskad överföring och mindre sjukdom^1,4,5. Gendrivsystemet kopierar sig själv och det tillhörande draget från en homolog kromosom till en annan i de pre meiotiska könscellerna, och detta säkerställer att majoriteten av avkomman ärver enheten och skapar potential för långvarig och hållbar populationsmodifiering i fältet. En nackdel med Cas/gRNA-baserade metoder är dock möjligheten att generera infognings- och raderingsmutationer (indel) genom icke-homolog end-joining (NHEJ) DNA-reparation, vilket resulterar i generering av drivbeständiga alleler, som när de ackumuleras till en tillräckligt hög frekvens i befolkningen kan stoppa drivsystemet från att sprida^{sig 1,2,3,4} . Detta protokoll beskriver en hög genomströmning och tillförlitlig metod som kan bestämma prevalensen och den relativa mängden indelmutationer, på både befolknings- och individnivå, under Cas/gRNA-baserad gendrift.

Nästa generations sekvenseringsmetoder (NGS) ger oöverträffad sekvenseringsupplösning. De kostnader och tekniska krav som är förknippade med NGS förbjuder dock rutintester och begränsar dess användning som en metod med hög genomströmning för att bedöma^{indels 6,7,8}. Traditionella PCR-kvantifieringsmetoder har länge använts som standardutvärderingsförfarande för genom indels. Dessa metoder är dock arbetsintensiva, tar lång tid att skaffa data och har en hög grad av variabilitet. Digital-Droplet PCR (ddPCR) har visat sig vara känsligare för att upptäcka mutationer än Sanger sekvensering i vissa applikationer och har en lägre detektionsgräns än NGS i andra^6,7,8,9. Dessutom är kostnaden för att bedöma en provuppsättning och vändningstid för att uppnå resultat billigare respektive snabbare för ddPCR än antingen Sanger-sekvensering eller NGS⁹. Med hjälp av ett dubbelsondsystem identifierar drop-off-analysen NHEJ-alleler baserat på frånvaron av WT-sekvens (wild-type) vid den gRNA-riktade mål cas9-klippplatsen. I denna analys förstärks en kort amplicon inklusive den förväntade skärplatsen för Cas/gRNA-baserade systemet med ett specifikt primerpar. En fluorescerande sond är utformad för att binda till en bevarad region av amplicon och en annan fluorescerande sond känner igen WT-sekvensen av klippplatsen. I närvaro av en NHEJ-allel kommer den senare inte att binda till ampliconen.

Användningen av ddPCR ger möjlighet att designa primers för att rikta borttagningar, skillnader och infogningar med ett enda baspar, vilket möjliggör NHEJ-profilering i myggpopulationsanalyser⁹. Med tanke på dessa attraktiva funktioner skapade vi ett protokoll för ddPCR för hög genomströmningsdetektering av indel som genereras från ett Cas/ gRNA-baserat gendrivsystem i myggor.

Protocol

1. DNA-extraktion Förbered EDTA/Nuclei Lysis Buffer (EDTA/NLS) med förhållandet 500 μL NLS och 120 μL EDTA per prov. Uppskalning för flera exempel. Kyl blandningen på is.OBS: Lösningen blir grumlig på 2-5 min när den kyls beroende på volymen. Homogenisera myggprovet med en mekanisk homogenisator för 10-15 s i ett 1,5 mL mikrocentrifugerör fyllt med 600 μL kyld EDTA/NLS; blanda noggrant. Tillsätt 17,5 μL proteinas K till röret och blanda ordentligt. Inkubera över natten vid 55 °C. Omväxlande, inkubera provet vid 55 °C i 3 timmar med skakning och virvla provet var 1 timme. Tillsätt 200 μL proteinutfällningslösning till rumstemperaturprovet och virvla kraftigt i 20 s. Kyl provet i 5 minuter på is. Centrifugera provet till pelletsproteiner vid 15 890 RCF i 4 minuter. Aspirera försiktigt på supernatanten som innehåller DNA och överför det till ett rent 1,5 mL mikrocentrifugerör som innehåller 600 μL isopropanol. Blanda försiktigt lösningen genom att vända röret 5-10 gånger. Centrifugera i 1 min vid 15 890 RCF. Dekantera försiktigt supernatanten samtidigt som DNA-pelleten bevaras. Tillsätt 600 μL 70% etanol i rumstemperatur. Tvätta det pelleterade DNA:t genom att försiktigt invertera röret. Centrifugera i 1 min vid 15 890 RCF. Ta försiktigt bort supernatanten genom att aspireras med en pipettspets av glas. Vänd röret till rent absorberande papper och lufttorka pelleten i 10-15 min. Återanvänd DNA:t med PCR-klassat vatten. Använd 20 μL per enskilt myggprov eller 100 μL för 10 poolade myggor.OBS: DNA-extraktionsmetoder för myggprover med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit (se Tabell över material) är anpassade från tillverkarens isolerande genomiska DNA från vävnadskulturceller och djurvävnadsprotokoll. 2. ddPCR-reaktioner och beredning av droppgeneration Kvantifiera DNA med hjälp av en fluorometer.OBS: För avlämningsanalysen rekommenderas att använda ett intervall på 3 000-30 000 haploidgenomkopior per reaktion, som är utformat för att upptäcka NHEJ-händelser med en HEX-märkningssond som binder till en WT-sekvens av den riktade klippplatsen och inte kommer att glödga (drop-off) om det finns en borttagning eller insättning på målplatsen, indikerar förekomsten av en NHEJ-variant. Beräkna kopieringsnumret med haploidgenomets vikt och koncentration av DNA i extraktet. Detta görs genom att multiplicera koncentrationen av det extraherade DNA med den volym som används för att erhålla den totala DNA-massan och sedan dividera den med haploidgenomvikten. Se till att den tillsatta volymen är mellan 1-10 μL. Späd vid behov för att ingå i det rekommenderade haploida genomkopieringsområdet.OBS: En Anopheles gambiae haploid genom uppskattas till 0,27 pg per vuxen mygga10. Designa primers och sonder. Designa framåt- och omvända oligonukleotidprimrar med en Primer Melting Temperature (Tm) i intervallet 55-60 °C som flankerar 5′- och 3′-ändarna av gRNA-målplatsen som producerar en amplicon på 150-400 bp. HEX(Hexachloro-fluorescein)-märkt sond för NHEJ-detektering: Designa en oligonukleotid på ~15-20 bp som komplement till målplatsen och tillsätt HEX-sonden till 5′-end och BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) till 3′ slutet. Hydrolyssondens tm bör vara 3-10 °C högre än primers Tm. FAM (6-karboxyfluorescein)-märkt sond för referens WT: Designa en oligonukleotid ~15-20 bp i längd som kompletterar en bevarad genomplats avlägsna (ca 25 bp) från målplatsen och tillsätt FAM-sonden till 5′-end och BHQ1 till 3′ slutet. Hydrolyssondens tm bör vara 3-10 °C högre än primers Tm. 3. PCR reaktionspreparat Förbered 25 μL av ddPCR-provblandningen med följande komponenter: ddPCR supermix för sonder (ingen UTP): 12,5 μL, framåt och omvända primers (10 μM): 1 μL vardera, HEX/FAM-sonder (10 μM): 0,625 μL vardera, DNA: 1-5 μL (3,750-3,750-37, μL. Blanda reaktionerna noggrant genom att virvla eller återloppera pipetter (upp och ner) (20x).OBS: Om reaktionerna är i en 96-brunnsplatta, pipettera hela volymen upp och ner 20 gånger i stället för att virvla för att undvika bubbelbildning. Centrifugera kortfattat proverna för att lösa blandningen i botten av röret eller brunnen.OBS: Se till att reaktionerna är i rumstemperatur för droppgenerationen. Förbered 1x ddPCR-blandning för extra/oanvända brunnar i varje patron (varje patron har 8 brunnar). 4. Droppgeneration Använd en 50 μL flerkanalig pipett och lasta 20 μL av ddPCR-provblandningen i patronens mittrad(figur 1A, överst). Lasta 70 μL av oljan i den nedre raden. Ladda 20 μL 1x ddPCR supermix i oanvända brunnar.OBS: Introducera inte bubblor. Placera packningen vidrör bara kanterna och undvik det centrala konkaverade området (figur 1B). Placera plattan ordentligt i droppgeneratorn och stäng locket för att starta körningen. Överför 40 μL av emersionsblandningen från patronens översta rad(figur 1A, botten) till 96-brunnsplattan. Rita vätskeprov för 3-5 s i 45-30° vinkel. Utvisa blandningen långsamt i över 3 s i 45° vinkel i sidan av brunnen, så att den kan droppa ner på sidan. Det är okej att gå till det andra stoppet (fullständig utvisning) av pipetten för att utvisa all vätska. Försegla plattorna i 5 s vid 180 °C med hjälp av värmetätningar för folie. 5. PCR Placera den förseglade plattan i termocykeln(bild 1C) och ställ in de rekommenderade PCR-villkoren om du följer NHEJ-avlämningsriktlinjerna enligt följande: Initial denaturation vid 95 °C i 10 min. Ställ in 40 cykler på 94 °C för 30 s till denatur, 55 °C i 1 min till glödgning och 60 °C i 2 minuter för att förlänga. Håll vid 98 °C i 10 min. Håll vid 4 °C.OBS: Glödgningstemperaturen för specifika primers och sonduppsättningar kan optimeras med hjälp av en termisk gradient. Använd en ramphastighet på 2 °C/s för alla steg. PCR-villkoren bör justeras beroende på varje experimentell design och inställning. 6. Droppläsning Placera plattan säkert i droppläsaren med brunn A-1 längst upp till vänster (utjämnat hörn, de andra tre är kantade) (Bild 1D). Ställ in plattan i programmet: Ange FAM som den kända referenskanalen och HEX som den okända (figur 2A). Kör Droplet-läsexperimentet som direkt kvantifiering. När körningen är klar ändrar du experimenttypen till Drop-Off (DOF) för analysen (figur 2A). 7. Analys Ange rätt experimentella parametrar (figur 2A): Provinformation, SuperMix, Målnamn (WT eller NHEJ), Måltyp (Ref eller Okänd), Signal Ch1 (HEX eller FAM), Signal Ch2 (HEX eller FAM) och ställ manuellt in tröskeln för droppantal (rekommenderar över 10 000 för tillförlitliga resultat). Programvaran kommer att utföra det mesta av analysen med den angivna parametern. Kontrollera antalet droppar på fliken Släpp. se till att alla ligger över 10 000 (figur 2B). Kontrollera 1 D amplitud för effektiv signalseparation från negativ. Markera hela plattan i Plåtredigerarenoch ställ in experimenttypen på avlämning. Ange WT-målet som referens, ange kanal ett för FAM och kanal två för HEX. Ange NHEJ-målet som okänt och ange kanal ett för FAM och kanal två som ingen. Ange klustertrösklarna med diagramverktygen för varje exempel på fliken 2D-amplitud. Tänk på svansen som är associerad med WT-klustret. Detta är normalt för NHEJ-analyser (figur 3A).Klicka på kugghjulsikonen längst upp till höger i diagrammet under fliken Förhållande. Välj fraktionellt överflöd. Diagrammet ritar nu en punkt som motsvarar procentandelen NHEJ-händelser (figur 3B).

Representative Results

En tillämpning av detta förfarande förekommer i Carballar-Lejarazú et al.9. DdPCR Drop-off-analysen använder två fluorescerande sonder för att urskilja WT- och indelsekvenser: En FAM-sond binder till en bevarad sekvens inom ampliconen, medan HEX-sonden riktar in sig på WT-sekvensen på den riktade platsen(figur 4A). I närvaro av en indel kommer HEX-sonden inte att binda. Representativa resultat finns i figur 2,tabell 1 och tabell 2 i Carballar-Lejarazú et al.9. Med hjälp av detta protokoll har ddPCR visat sig upptäcka en mängd olika CRISPR-Cas9 inducerade NHEJ-händelser och kvantifiera NHEJ-frekvensen i ett enskilt eller poolat prov. Femton olika poolade prover av 10 myggor innehöll varsin NHEJ-allel (tabell 2 i Carballar-Lejarazú et al.9). Dessa analyserades med ddPCR med hjälp av protokollet och parametrar som presenteras här. Resultaten från tabell19 visar att alla 15 proverna innehöll 100 % indel alleler enligt avlämningsanalysen(figur 4B). I ett annat experiment undersöktes 11 poolade prover av WT-myggor och NHEJ-myggor med olika NHEJ-procentsatser (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% och 100%) med detta ddPCR-protokoll, och resultaten(figur 2; Carballar- Lejarazú et al.9) visade att den identifierade procentsatsen ligger nära den jämförda tekniken för Indel Detection by Amplicon Analysis(figur 4C). Figur 1: Experimentellt inrättande och förfarande. (A)Patronpreparering för Droplet-generationen. (Överst) Proverna fylls i patronens mittrad, medan oljan fylls i den nedre raden. (Nederkant) Översta raden fylld med emulgerade droppar efter droppgeneration. b)Droppgenerator med en patron fylld med prov och täckt av en packning på plats. c)96-brunnsplatta täckt med folietätning i en Termocykel. (D) Droppläsare med 96-brunnsplatta på plats med ett metallhölje låst över plattan för att säkra den. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Bild 2: Droppläsning. (A) Programvarugränssnitt för droppavläsning. Orange lådor visar brunnar med prover. Grå lådor är tomma brunnar. Experimentella parametrar ställs in på panelen Redigera verktyg (höger sida). Varje prov kan redigeras genom att klicka på respektive provruta. Välj Drop Off (DOF) för experimentell typ. Fyll i lämplig information för exemplets namn och typi exempelinformation samt SuperMix. Välj det grundläggande avlämnings avropet för analysinformationen. För WT-exemplet väljer du WT för målnamnet, Ref för måltypoch både FAM och HEX för Signal Ch1 respektive Ch2. För NHEJ-exempel fyller du i lämpligt namn för målnamnet, väljer Okänd för måltypenoch väljer FAM för Signal Ch1. Lämna signal ch2 på ingen. (B)Droplet-antal resultat för flera prover. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 3: Analys av drop-off-analys. (A) Kluster 2D-plot för droppräkningen för WT- och NHEJ-allelerna. På fliken 2D-amplitud är alla droppar oklassificerade som standard. I den här figuren tilldelas färger manuellt för att särskilja. Orange dots-klustret är WT-allelantal som erhålls genom bindning av både FAM- och HEX-sonder vid referenssekvensen respektive målplatssekvensen. Blå punkter representerar mängder av droppar som har FAM-bindning till referenssekvensen men ingen HEX-bindning vid målplatssekvensen (därav avlämning av HEX). Grå prickar är tomma droppar som inte har varken FAM- eller HEX-bindning. (B) Diagram över förhållande/överflöd av NHEJ-händelser. Under fliken Förhållande väljer du Bråktalsfördkomst för ett diagram med korrespondentprocenten för NHEJ-händelser. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 4: Tillämpning av drop-off-analys med ddPCR för icke-homolog identifiering och kvantifiering av end-join i den transgena Anopheles stephensi-linjen, AsMCRkh1. (A) Schematisk presentation av ddPCR Drop-Off-analysen för att upptäcka mutationer på ett riktat DNA-ställe med ett system med dubbla sonder. En amplicon på 150-400 bp förstärks med fram- och bakåtprimer. En FAM-märkt sond är utformad för att binda till en bevarad sekvens av ampliconen, medan en HEX-märkt sond är utformad för att binda till WT gRNA-målplatsen. (B)Detektion av olika typer av indel med ddPCR. Femton pooler med 10 AsMCRkh1 myggor som var och en innehåller olika typer av indel, inklusive insättning, borttagning och substitution, analyserades med ddPCR Drop-Off analysen. Detaljer om mutationer och sekvenser finns i tabell 2 och tabell S3 i Carballar et al. 9. (C) Kvantifiering av NHEJ i blandade prover av AsMCRkh1 och WT myggor med olika förhållanden (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 och 0:10) med ddPCR och en jämförd teknik av IndelDetection. Bilder anpassade från Carballar-Lejarazú et al. Biotechniques. 68(4):172-179 (2020)9. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Primer/Sond Sekvens (5′ » 3′) ddPCR Framåt Primer ATGATCAAATGTCGACCG ddPCR omvänd primer ACCGTACTGGTTGAACA ddPCR HEX-sond (BHQ1) [HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1] ddPCR FAM-sond (BHQ1) [6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1] HEX: Hexachloro-fluorescein, FAM: 6-karboxyfluorescein, BHQ: Svart hål Quencher Tabell 1: Sekvenser av primers och sonder.

Discussion

Digital-droplet PCR är en effektiv metod för att bestämma förekomsten av indel alleler som härrör från NHEJ-händelser i ett Cas/gRNA-baserat gendrivsystem och möjliggör kvantifiering av frekvensen av dessa alleler hos individer eller populationer. Vissa steg i protokollet måste följas med särskild omsorg för att uppnå tillförlitliga resultat. För det första måste den genomiska DNA-extraktionen utföras noggrant för att säkerställa hög kvalitet och tillräcklig kvantitet. En bra extraktion möjliggör korrekt bestämning av haploidgenomkopior per reaktion. Enligt vår erfarenhet tillhandahöll ett kommersiellt tillgängligt kit (se tabell över material)konsekvent högkvalitativa DNA-extraktioner. Extraktioner av enskilda myggor kan dock visa sig vara särskilt utmanande eftersom DNA-pelleten blir svår att visualisera och lätt kan sugas upp med supernatanten om inte försiktig. För det andra måste primers och sonder utformas noggrant. Innan du slutför ddPCR-experimentet, se till att de designade primers resulterar i en enda PCR-produkt genom att först utföra en traditionell PCR och visualisera en enda produkt via gelelektrofores. Referens-FAM-sonden måste också utformas så att den kompletterar en mycket bevarad sekvens. Detta kommer att säkerställa korrekta upptäckter av WT-alleler i en mångfaldig befolkning. Primer/sondkombinationerna för varje unikt experiment kommer att ha olika termocykelförhållanden, och det rekommenderas att optimera dessa förhållanden med hjälp av en termisk gradient.

Det finns andra metoder för att identifiera indels, till exempel Sanger-sekvensering eller NGS. Sanger-sekvensering är begränsad eftersom den har en lägre gräns för upptäckt och låg upptäcktskraft för att identifiera nya varianter. Sanger sekvensering är också arbetsintensiv och är inte hög genomströmning. Jämfört med Sanger-sekvensering har NGS inte samma begränsningar av låg känslighet, upptäcktskraft och dataflöde. En annan fördel med NGS är dess förmåga att upptäcka en mängd mutationer från enstaka nukleotidpolymorfism (SNPs) till omorganiseringar. NGS är dock en dyrare och tidskrävande metod vid tillämpning av att bestämma Cas9/gRNA-associerade indels eftersom det bara finns en målregion av intresse, och den är bäst lämpad för större genomomfattande analyser. Jämfört med de ovan nämnda metoderna är ddPCR hög genomströmning och har en snabb vändningstid. Om ddPCR-materialen och ddPCR-materialen finns tillgängliga internt kan 96 prover bearbetas inom 1-2 dagar, vilket gör det väl lämpat för snabb analys av stora försök av Cas9/gRNA-modifierade organismer.

Även om det finns många fördelar för ddPCR finns det också begränsningar. För det första är ddPCR-utrustningen inte ofta tillgänglig i en oberoende laboratoriemiljö. ddPCR-utrustning kan vara tillgänglig gemensamt vid större forskningsinstitutioner, men detta gör det inte möjligt att underlätta datagenerering och dataanalys utanför institutionen. För det andra, till skillnad från alternativen, ger ddPCR inte de enskilda unika sekvenserna av identifierade indelmutationer. Digital-droplet PCR kommer att ge frekvensen av indel mutationer inom en population, men utan sekvensen, man kan inte avgöra om de indels närvarande är mer benägna att bevara eller hämma funktionen av genen av intresse. DdPCR-metoden är kanske bäst lämpad att analysera vilda populationer efter en fältutgivningsstudie av en Cas9/gRNA-baserad drivorganism eftersom den effektivt kan bestämma frekvensen av introduktion av transgenen i den inhemska befolkningen och genereringen av indel inom befolkningen i nära realtid. På grund av ddPCR:s snabba vändningstid skulle det vara möjligt att utföra provtagning och analysera populationen i en fältförsöksregion varje vecka om material fanns tillgängligt lokalt. Startkostnaderna för att köpa, importera och installera ddPCR-utrustning skulle vara höga i fjärrlaboratorier, men fördelarna med att kunna bedöma en vild population noggrant eftersom den genomgår ändringar från ett drivsystem skulle motivera kostnaderna.

Materials

Reagents
ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863024
DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit)	Promega	A1120
EDTA (pH 8.0)	Invitrogen	AM9260G
Ethanol, 200 Proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
Isopropanol (Certified ACS)	Thermo Fisher Scientific	A416-500
Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit)	Promega	A1120
PCR-grade Water			Any certified PCR-grade water can be used
Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit)	Promega	A1120
Proteinase K 20 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	AM2546
Materials
ddPCR 96-Well Plate	Bio-Rad	12001925
Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets	Bio-Rad	1864007
Droplet Generation Oil for probes	Bio-Rad	1863005
Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes)	Sigma-Aldrich	N/A	Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.
Forward and Reverse oligonucleotide primers	Sigma-Aldrich	N/A	Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.
Equipment
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1851148	Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well