Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg
Summary
Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.
Abstract
De neuromusculaire verbinding (NMJ) is een gespecialiseerd contactpunt tussen de motorische zenuw en de skeletspier. Deze perifere synaps vertoont een hoge morfologische en functionele plasticiteit. Bij tal van aandoeningen van het zenuwstelsel is NMJ een vroeg pathologisch doelwit dat resulteert in neurotransmissiefalen, zwakte, atrofie en zelfs in spiervezeldood. Vanwege de relevantie ervan kan de mogelijkheid om bepaalde aspecten van de relatie tussen NMJ-componenten kwantitatief te beoordelen, helpen om de processen in verband met de assemblage / demontage ervan te begrijpen. Het eerste obstakel bij het werken met spieren is om de technische expertise op te doen om snel te identificeren en te ontleden zonder hun vezels te beschadigen. De tweede uitdaging is om hoogwaardige detectiemethoden te gebruiken om NMJ-beelden te verkrijgen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve analyses uit te voeren. Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol voor het ontleden van extensor digitorum longus en soleus spieren van ratten. Het verklaart ook het gebruik van immunofluorescentie om pre- en postsynaptische elementen van nmj’s met hele montering te visualiseren. Verkregen resultaten tonen aan dat deze techniek kan worden gebruikt om de microscopische anatomie van de synapsis vast te stellen en subtiele veranderingen in de status van sommige van zijn componenten onder fysiologische of pathologische omstandigheden te identificeren.
Introduction
De zoogdier neuromusculaire verbinding (NMJ) is een grote cholinerge tripartiete synaps bestaande uit de motor neuron zenuw einde, de postsynaptische membraan op de skelet spiervezel, en de terminale Schwann cellen1,2,3. Deze synaps vertoont een hoge morfologische en functionele plasticiteit4,5,6,7,8,zelfs tijdens de volwassenheid wanneer NMJ’s dynamische structurele wijzigingen kunnen ondergaan. Sommige onderzoekers hebben bijvoorbeeld aangetoond dat motorische zenuwuiteinden voortdurend van vorm veranderen op de micrometerschaal9. Er is ook gemeld dat de morfologie van de NMJ reageert op functionele vereisten, gewijzigd gebruik, veroudering, oefening of variaties in motorische activiteit4,10,11,12,13,14,15. Training en gebrek aan gebruik vertegenwoordigen dus essentiële stimulansen om bepaalde kenmerken van de NMJ te wijzigen, zoals de grootte, lengte, dispersie van synaptische blaasjes en receptoren, evenals zenuwterminalvertakking14,16,17,18,19,20.
Bovendien is aangetoond dat elke structurele verandering of degeneratie van deze vitale verbinding kan leiden tot motorneuronceldood en spieratrofie21. Er wordt ook gedacht dat veranderde communicatie tussen zenuwen en spieren verantwoordelijk kan zijn voor de fysiologische leeftijdsgebonden NMJ-veranderingen en mogelijk voor de vernietiging ervan in pathologische toestanden. Neuromusculaire junction ontmanteling speelt een cruciale rol bij het begin van Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS), een neurodegeneratieve ziekte die een van de beste voorbeelden is van verminderd spier-zenuwspel3. Ondanks de talrijke studies uitgevoerd op motorneurondisfunctie, wordt nog steeds gediscussieerd of de verslechtering waargenomen in ALS optreedt als gevolg van de directe schade in het motorneuron en zich vervolgens uitstrekt tot de cortico-spinale projecties22; of als het moet worden beschouwd als een distale axonoopathie waarbij degeneratie begint in de zenuwuiteinden en vordert naar het motorneuron somas23,24. Gezien de complexiteit van ALS-pathologie is het logisch om te overwegen dat er een mix van onafhankelijke processen plaatsvindt. Aangezien NMJ de centrale speler is van het fysiopathologische samenspel tussen spier en zenuw, vertegenwoordigt de destabilisatie ervan een cruciaal punt in de oorsprong van de ziekte dat relevant is om te worden geanalyseerd.
Het neuromusculaire systeem van zoogdieren is functioneel georganiseerd in discrete motorische eenheden, bestaande uit een motorneuron en de spiervezels die uitsluitend door de zenuwterminal worden geinvat. Elke motorunit heeft vezels met vergelijkbare of identieke structurele en functionele eigenschappen25. Motorneuron selectieve rekrutering maakt het mogelijk om de spierrespons op functionele eisen te optimaliseren. Nu is het duidelijk dat skeletspieren van zoogdieren uit vier verschillende vezeltypen bestaan. Sommige spieren worden genoemd volgens de kenmerken van hun meest voorkomende vezeltype. Bijvoorbeeld, de soleus (een achterste spier van de achterste ledemaat betrokken bij het behoud van de lichaamshouding) draagt een meerderheid van slow-twitch eenheden (type 1) en wordt herkend als een langzame spier. In plaats daarvan bestaat extensor digitorum longus (EDL) in wezen uit eenheden met vergelijkbare fast-twitch-eigenschappen (type 2-vezels) en staat bekend als een snelle spier die gespecialiseerd is in phasische bewegingen die nodig zijn voor voortbeweging. Met andere woorden, hoewel volwassen spieren plastic van aard zijn vanwege de hormonale en neurale invloeden, bepaalt de vezelsamenstelling het vermogen om verschillende activiteiten uit te voeren, zoals te zien is in soleus dat continue activiteit met lage intensiteit ervaart en EDL die een snellere enkele twitch vertoont. Andere kenmerken die variabel zijn tussen verschillende soorten spiervezels zijn gerelateerd aan hun structuur (mitochondriale inhoud, uitbreiding van sarcoplasmatisch reticulum, dikte van de Z-lijn), myosine ATPase-gehalte en myosine zware kettingsamenstelling26,27,28,29.
Voor knaagdier NMJ’s zijn er significante verschillen tussen spieren28,29. Morfometrische analyses uitgevoerd in soleus en EDL van ratten toonden een positieve correlatie aan tussen het synaptische gebied en de vezeldiameter (d.w.z. het synaptische gebied in soleus langzame vezels is groter dan in EDL snelle vezels), maar de verhouding tussen NMJ-gebied en vezelgrootte is vergelijkbaar in beide spieren30,31. Ook, met betrekking tot de zenuwterminals, waren de eindplaat absolute gebieden in type 1 vezels lager dan in type 2 vezels, terwijl de normalisatie door vezeldiameter gebieden van zenuwterminals in type 1 vezels de grootste32maakte.
Er zijn echter maar weinig studies gericht op morfometrische analyse om het bewijs van veranderingen in sommige NMJ-componenten33,34 aante tonen . Vanwege de relevantie van de NMJ in de functie van het organisme, waarvan de morfologie en fysiologie in verschillende pathologieën worden gewijzigd, is het dus belangrijk om dissectieprotocollen van verschillende soorten spieren te optimaliseren met voldoende kwaliteit om de visualisatie van de hele NMJ-structuur mogelijk te maken. Het is ook noodzakelijk het optreden van pre – of postsynaptische veranderingen in verschillende experimentele situaties of omstandigheden zoals veroudering of oefening35,36,37,38te evalueren . Bovendien kan het nuttig zijn om subtielere veranderingen in NMJ-componenten te bewijzen, zoals veranderde neurofilamentfosforylatie in de terminale zenuwuiteinden zoals gerapporteerd in ALS39.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor de dissectie van twee skeletspieren van ratten (een langzame twitch en de andere fast-twitch), vezelspierisolatie en immunofluorescentiedetectie van pre- en postsynaptische markers om NMJ-veranderingen en assemblage- / demontageprocessen kwantitatief te beoordelen. Dit soort protocol kan nuttig zijn in knaagdiermodellen41,42 om NMJ te evalueren tijdens fysiologische of pathologische processen zoals hie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Veel dank aan CSIC en PEDECIBA voor de financiële steun die aan dit werk is verleend; aan Natalia Rosano voor haar manuscriptcorrecties; aan Marcelo Casacuberta die de video maakt en aan Nicolás Bolatto voor het lenen van zijn stem ervoor.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 – AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -. S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
