Dissection des fibres musculaires squelettiques simples pour les analyses immunofluorescentes et morphométriques des jonctions neuromusculaires de mont entier
Summary
La capacité de détecter avec précision les composants neuromusculaires de jonction est cruciale en évaluant les modifications de son architecture en raison des processus pathologiques ou développementaux. Nous présentons ici une description complète d’une méthode simple pour obtenir des images de haute qualité de jonctions neuromusculaires à montage entier qui peuvent être utilisées pour effectuer des mesures quantitatives.
Abstract
La jonction neuromusculaire (NMJ) est un point de contact spécialisé entre le nerf moteur et le muscle squelettique. Cette synapse périphérique présente une plasticité morphologique et fonctionnelle élevée. Dans de nombreux désordres de système nerveux, NMJ est une cible pathologique tôt ayant pour résultat l’échec de neurotransmission, la faiblesse, l’atrophie, et même dans la mort de fibre musculaire. En raison de sa pertinence, la possibilité d’évaluer quantitativement certains aspects de la relation entre les composants NMJ peut aider à comprendre les processus associés à son assemblage / démontage. Le premier obstacle lorsque vous travaillez avec les muscles est d’acquérir l’expertise technique pour identifier et disséquer rapidement sans endommager leurs fibres. Le deuxième défi consiste à utiliser des méthodes de détection de haute qualité pour obtenir des images NMJ qui peuvent être utilisées pour effectuer des analyses quantitatives. Cet article présente un protocole étape par étape pour disséquer le longus de digitorum d’extenseur et les muscles de soleus des rats. Il explique également l’utilisation de l’immunofluorescence pour visualiser les éléments pré et postsynaptiques des NMJs à montage entier. Les résultats obtenus démontrent que cette technique peut être utilisée pour établir l’anatomie microscopique de la synapse et identifier des changements subtils dans le statut de certains de ses composants dans des conditions physiologiques ou pathologiques.
Introduction
La jonction neuromusculaire du mammifère (NMJ) est une grande synapse cholinergique tripartite composée de la terminaison nerveuse du motoneurone, de la membrane postsynaptique sur la fibre musculaire squelettique et des cellules terminales de Schwann1,2,3. Cette synapse présente une plasticité morphologique etfonctionnelle élevée4,5,6,7,8,même à l’âge adulte lorsque les NMJ peuvent subir des modifications structurelles dynamiques. Par exemple, certains chercheurs ont montré que les terminaisons nerveuses motrices changent continuellement de forme à l’échelle micrométrique9. Il a également été rapporté que la morphologie du NMJ répond aux exigences fonctionnelles, à l’utilisation altérée, au vieillissement, à l’exercice ou aux variations de l’activité locomoteur4,10,11,12,13,14,15. Ainsi, l’entraînement et le manque d’utilisation représentent un stimulus essentiel pour modifier certaines caractéristiques du NMJ, telles que sa taille, sa longueur, la dispersion des vésicules synaptiques et des récepteurs, ainsi que la branche terminale nerveuse14,16,17,18,19,20.
En outre, il a été démontré que tout changement structurel ou dégénérescence de cette jonction vitale pourrait entraîner la mort cellulaire des motoneurones et l’atrophie musculaire21. On le pense également que la communication changée entre les nerfs et les muscles pourrait être responsable des changements physiologiques relatifs à l’âge nmj et probablement de sa destruction dans des états pathologiques. Le démantèlement de la jonction neuromusculaire joue un rôle crucial dans l’apparition de la sclérose latérale amyotrophique (SLA), une maladie neurodégénérative qui constitue l’un des meilleurs exemples d’interaction muscle-nerf altérée3. Malgré les nombreuses études menées sur le dysfonctionnement des motoneurones, on débat encore si la détérioration observée dans la SLA se produit en raison des dommages directs dans le motoneurone puis s’étend aux projections cortico-spinales22; ou si elle doit être considérée comme une axonopathie distale où la dégénérescence commence dans les terminaisons nerveuses et progresse vers les somas des motoneurones23,24. Compte tenu de la complexité de la pathologie de la SLA, il est logique de considérer qu’un mélange de processus indépendants se produit. Comme NMJ est l’acteur central de l’interaction physiopathologique entre le muscle et le nerf, sa déstabilisation représente un point pivot dans l’origine de la maladie qui est pertinent à analyser.
Le système neuromusculaire du mammifère est fonctionnellement organisé en unités motrices discrètes, composées d’un motoneurone et des fibres musculaires qui sont exclusivement innervées par sa borne nerveuse. Chaque unité motrice possède des fibres ayant des propriétés structurelles et fonctionnelles similaires ou identiques25. Le recrutement sélectif des motoneurones permet d’optimiser la réponse musculaire aux exigences fonctionnelles. Maintenant, il est clair que les muscles squelettiques des mammifères sont composés de quatre types de fibres différents. Certains muscles sont nommés en fonction des caractéristiques de leur type de fibre le plus abondant. Par exemple, le soleus (un muscle postérieur du membre postérieur impliqué dans le maintien de la posture du corps) porte une majorité d’unités à contraction lente (type 1) et est reconnu comme un muscle lent. Au lieu de cela, extenseur digitorum longus (EDL) est essentiellement composé d’unités avec des propriétés de contraction rapide similaires (fibres de type 2) et est connu comme un muscle rapide spécialisé pour les mouvements phasiques nécessaires à la locomotion. En d’autres termes, bien que les muscles adultes soient plastiques dans la nature en raison des influences hormonales et neurales, sa composition en fibres détermine la capacité d’effectuer différentes activités, comme on le voit dans le soleus qui connaît une activité continue de faible intensité et l’EDL qui présente une contraction unique plus rapide. D’autres caractéristiques qui sont variables parmi les différents types de fibres musculaires sont liées à leur structure (contenu mitochondrial, extension du réticulum sarcoplasmique, épaisseur de la ligne Z), teneur en atpase de myosine, et la composition de la chaîne lourde de myosine26,27,28,29.
Pour les NMJ de rongeurs, il existe des différences significatives entre les muscles28,29. Les analyses morphométriques réalisées dans le soleus et l’EDL chez le rat ont indiqué une corrélation positive entre le secteur synaptique et le diamètre de fibre (c.-à-d., le secteur synaptique dans les fibres lentes de soleus est plus grand que dans les fibres rapides EDL) mais le rapport entre le secteur NMJ et la taille de fibre est semblable dans les deux muscles30,31. En outre, en ce qui concerne les bornes nerveuses, les zones absolues de la plaque d’extrémité dans les fibres de type 1 étaient plus faibles que dans les fibres de type 2, tandis que la normalisation par diamètre de la fibre a fait des zones de bornes nerveuses dans les fibres de type 1 les plus grandes32.
Cependant, très peu d’études se concentrent sur l’analyse morphométrique pour montrer la preuve de changements dans certaines des composantes NMJ33,34. Ainsi, en raison de la pertinence du NMJ dans la fonction de l’organisme, dont la morphologie et la physiologie sont altérées dans diverses pathologies, il est important d’optimiser les protocoles de dissection de différents types de muscles avec une qualité suffisante pour permettre la visualisation de l’ensemble de la structure NMJ. Il est également nécessaire d’évaluer l’apparition de changements pré ou postsynaptiques dans différentes situations ou conditions expérimentales telles que le vieillissement ou l’exercice35,36,37,38. En outre, il peut être utile de mettre en évidence des altérations plus subtiles des composants nmj tels que la phosphorylation altérée de neurofilament dans les terminaisons nerveuses terminales comme indiqué dans la SLA39.
Protocol
Representative Results
Discussion
En cet article, nous présentons un protocole détaillé pour la dissection de deux muscles squelettiques de rat (un lent-contraction et l’autre rapide-contraction), l’isolement de muscle de fibre et la détection d’immunofluorescence des marqueurs pre et postsynaptic pour évaluer quantitativement des changements de NMJ aussi bien que des processus d’assemblage/démontage. Ce type de protocole peut être utile dans les modèlesrongeurs 41,42 pour évalue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un grand merci à la SIC et au PEDECIBA pour le soutien financier apporté à ces travaux; à Natalia Rosano pour ses corrections manuscrites; à Marcelo Casacuberta qui réalise la vidéo et à Nicolás Bolatto pour avoir prêté sa voix pour elle.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 – AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
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