Disseksjon av enkle skjelettmuskulaturfibre for immunfluorescerende og morfometriske analyser av hel-mount nevromuskulære veikryss
Summary
Evnen til å nøyaktig oppdage nevromuskulære koblingskomponenter er avgjørende for å evaluere modifikasjoner i arkitekturen på grunn av patologiske eller utviklingsmessige prosesser. Her presenterer vi en komplett beskrivelse av en enkel metode for å oppnå bilder av høy kvalitet av helmonterte nevromuskulære veikryss som kan brukes til å utføre kvantitative målinger.
Abstract
Det nevromuskulære krysset (NMJ) er et spesialisert kontaktpunkt mellom motornerven og skjelettmuskelen. Denne perifere synapsen utviser høy morfologisk og funksjonell plastisitet. I mange nervesystemforstyrrelser er NMJ et tidlig patologisk mål som resulterer i nevrotransmisjonssvikt, svakhet, atrofi og til og med i muskelfiberdød. På grunn av sin relevans kan muligheten til kvantitativt å vurdere visse aspekter av forholdet mellom NMJ-komponenter bidra til å forstå prosessene knyttet til montering / demontering. Det første hinderet når du arbeider med muskler er å få den tekniske kompetansen til raskt å identifisere og dissekere uten å skade fibrene. Den andre utfordringen er å bruke deteksjonsmetoder av høy kvalitet for å få NMJ-bilder som kan brukes til å utføre kvantitativ analyse. Denne artikkelen presenterer en trinnvis protokoll for dissekering av ekstensor digitorum longus og soleus muskler fra rotter. Det forklarer også bruken av immunfluorescens for å visualisere pre- og postsynaptiske elementer av helmonterte NMJs. Oppnådde resultater viser at denne teknikken kan brukes til å etablere den mikroskopiske anatomien til synapsen og identifisere subtile endringer i statusen til noen av komponentene under fysiologiske eller patologiske forhold.
Introduction
Pattedyret neuromuskulært kryss (NMJ) er en stor kolinrgisk trepartssynapse som består av motorisk nevronnervenden, den postsynaptiske membranen på skjelettmuskulaturfiberen og de terminale Schwann-cellene1,2,3. Denne synapsen viser høy morfologisk og funksjonell plastisitet4,5,6,7,8, selv under voksen alder når NMJs kan gjennomgå dynamiske strukturelle modifikasjoner. For eksempel har noen forskere vist at motoriske nerveender kontinuerlig endrer form på mikrometerskalaen9. Det er også rapportert at morfologien til NMJ svarer på funksjonelle krav, endret bruk, aldring, trening eller variasjoner i lokomotorisk aktivitet4,10,11,12,13,14,15. Dermed representerer trening og mangel på bruk essensiell stimulans for å endre noen egenskaper ved NMJ, for eksempel størrelse, lengde, spredning av synaptiske vesikler og reseptorer, samt nerveterminalgrening14,16,17,18,19,20.
Videre har det vist seg at enhver strukturell endring eller degenerasjon av dette vitale krysset kan føre til motorisk nevroncelledød og muskelatrofi21. Det antas også at endret kommunikasjon mellom nerver og muskler kan være ansvarlig for de fysiologiske aldersrelaterte NMJ-endringene og muligens for ødeleggelsen i patologiske tilstander. Neuromuscular kryss demontering spiller en avgjørende rolle i utbruddet av amyotrofisk lateral sklerose (ALS), en nevrodegenerativ sykdom som utgjør et av de beste eksemplene på nedsatt muskel-nerve samspill3. Til tross for de mange studiene som utføres på motorisk nevron dysfunksjon, er det fortsatt diskutert om forverringen observert i ALS oppstår på grunn av direkte skade på motornevronen og deretter strekker seg til kortiko-spinal projeksjonene22; eller hvis det skal betraktes som en distal axonopati der degenerasjon begynner i nerveendene og utvikler seg mot motornevronen somas23,24. Gitt kompleksiteten i ALS-patologi, er det logisk å vurdere at en blanding av uavhengige prosesser oppstår. Siden NMJ er den sentrale aktøren i det fysiopatiske samspillet mellom muskel og nerve, representerer destabiliseringen et sentralt punkt i opprinnelsen til sykdommen som er relevant for å bli analysert.
Pattedyrets nevromuskulære system er funksjonelt organisert i diskrete motorenheter, bestående av en motorisk nevron og muskelfibrene som utelukkende er innervated av nerveterminalen. Hver motorenhet har fibre med lignende eller identiske strukturelle og funksjonelle egenskaper25. Motor neuron selektiv rekruttering gjør det mulig å optimalisere muskelrespons på funksjonelle krav. Nå er det klart at pattedyr skjelettmuskulaturen består av fire forskjellige fibertyper. Noen muskler er navngitt i henhold til egenskapene til deres mest tallrike fibertype. For eksempel bærer soleus (en bakre muskel i bakre lem involvert i vedlikehold av kroppsstillingen) et flertall av langsomme rykninger (type 1) og er anerkjent som en langsom muskel. I stedet er extensor digitorum longus (EDL) i hovedsak sammensatt av enheter med lignende raske rykninger (type 2 fibre) og er kjent som en rask muskel spesialisert for fasiske bevegelser som trengs for bevegelse. Med andre ord, selv om voksne muskler er plastiske i naturen på grunn av hormonelle og nevrale påvirkninger, bestemmer fibersammensetningen kapasiteten til å utføre forskjellige aktiviteter, sett i soleus som opplever kontinuerlig lavintensitetsaktivitet og EDL som viser en raskere enkelt rykning. Andre funksjoner som er variable blant forskjellige typer muskelfibre er relatert til deres struktur (mitokondrieinnhold, utvidelse av sarkoplasmisk retikulum, tykkelsen på Z-linjen), myosin ATPaseinnhold og myosin tung kjedesammensetning26,27,28,29.
For gnager NMJs er det betydelige forskjeller mellom muskler28,29. Morfometriske analyser utført i soleus og EDL fra rotter avslørte en positiv sammenheng mellom synaptisk område og fiberdiameter (dvs. synaptisk område i soleus langsomme fibre er større enn i EDL raske fibre), men forholdet mellom NMJ-området og fiberstørrelsen er lik i begge musklene30,31. Også i forhold til nerveterminalene var endeplaten absolutte områder i type 1 fibre lavere enn i type 2 fibre, mens normaliseringen med fiberdiameter gjorde områder av nerveterminaler i type 1 fibre de største32.
Imidlertid fokuserer svært få studier på morfometrisk analyse for å vise tegn på endringer i noen av NMJ-komponentene33,34. På grunn av relevansen av NMJ i organismens funksjon, hvis morfologi og fysiologi endres i ulike patologier, er det viktig å optimalisere disseksjonsprotokoller av forskjellige typer muskler med kvalitet nok til å tillate visualisering av hele NMJ-strukturen. Det er også nødvendig å evaluere forekomsten av pre- eller postsynaptiske endringer i forskjellige eksperimentelle situasjoner eller forhold som aldring eller trening35,36,37,38. I tillegg kan det være nyttig å bevise mer subtile endringer i NMJ-komponenter som endret nevrofilamentfosforylering i terminale nerveender som rapportert i ALS39.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for disseksjon av to rotte skjelettmuskler (en langsom rykning og den andre raske rykninger), fibermuskelisolasjon og immunfluorescensdeteksjon av pre- og postsynaptiske markører for kvantitativt å vurdere NMJ-endringer samt montering / demonteringsprosesser. Denne typen protokoll kan være nyttig i gnagermodeller41,42 for å evaluere NMJ under fysiologiske eller patologiske prosesser som eksemplifisert h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tusen takk til CSIC og PEDECIBA for den økonomiske støtten som er gitt til dette arbeidet; til Natalia Rosano for hennes manuskriptkorreksjoner; til Marcelo Casacuberta som lager videoen og til Nicolás Bolatto for å låne stemmen sin for den.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 – AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -. S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
