Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

OnePot PURE cellfritt system

Published: June 23, 2021 doi: 10.3791/62625
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Bioengineering, School of Engineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar en snabb och kostnadseffektiv metod för att producera det rekombinanta PURE cellfria TX-TL-systemet med hjälp av standard laboratorieutrustning.

Abstract

Det definierade PURE (proteinsyntesen med hjälp av rekombinanta element) transkriptionsöversättningssystem ger ett tilltalande chassi för cellfri syntetisk biologi. Tyvärr är kommersiellt tillgängliga system kostsamma, och deras bedövningsförmåga är begränsad. I jämförelse kan en hemgjord metod anpassas baserat på användarnas behov. Beredningen av hemgjorda system är dock tidskrävande och mödosam på grund av behovet av ribosomer samt 36 medelstora proteinreningar. Effektivisering av proteinrening genom kokulturering och samrening gör det möjligt att minimera tids- och arbetskraven. Här presenterar vi en enkel, justerbar, tids- och kostnadseffektiv metod för att producera alla PURE-systemkomponenter inom 1 vecka, med hjälp av standard laboratorieutrustning. Dessutom är OnePot PURE:s prestanda jämförbar med kommersiellt tillgängliga system. OnePot PURE-beredningsmetoden utökar tillgängligheten till PURE-systemet till fler laboratorier på grund av dess enkelhet och kostnadseffektivitet.

Introduction

Cellfria TX-TL-system (Transcription-Translation) utgör en lovande plattform för att undersöka och konstruera biologiska system. De ger förenklade och tunable reaktionsförhållanden, eftersom de inte längre förlitar sig på livsuppehållande processer, inklusive tillväxt, homeostas eller regleringsmekanismer1. Således förväntas det att cellfria system kommer att bidra till undersökningen av biomolekylära system, erbjuda en ram för att testa rationella biodesignstrategier2och tillhandahålla ett chassi för en framtida syntetisk cell3,4. Det helt rekombinanta PURE-systemet erbjuder ett särskilt tilltalande chassi på grund av dess definierade och minimala sammansättning, liksom dess justerbarhet och justerbarhet5.

Sedan det första funktionella, helt rekombinanta PURE-systemet inrättades 20015har ansträngningar gjorts för att utöka systemgränserna och optimera systemets sammansättning för att förbättra systemets utbyten6,7,8, möjliggöra transkriptionsreglering9,membran10,11 och sekretorisk proteinsyntes12, och för att underlätta proteinvikning13,14 . Numera finns det tre kommersiellt tillgängliga system: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) och Magic PURE (Creative Biolabs). Dessa system är dock kostsamma, deras exakta sammansättning är proprietär och därmed okänd, och anpassningsförmågan är begränsad.

PURE-system som utarbetats internt visade sig vara det mest kostnadseffektiva och tunable alternativet15,16. De nödvändiga 37 reningsstegen för protein och ribosomfraktioner är dock tidskrävande och tråkiga. Flera försök har gjorts för att förbättra effektiviteten hos PURE-systemberedningen17,18,19. Vi visade nyligen att det är möjligt att kokultur och samrena alla nödvändiga icke-ribosomala proteiner som finns i PURE-systemet. Denna OnePot-metod har visat sig vara kostnadseffektiv och tidseffektiv, vilket minskar förberedelsetiden från flera veckor till 3 arbetsdagar. Tillvägagångssättet genererar ett PURE-system med en proteinproduktionskapacitet jämförbar med det kommersiellt tillgängliga PURExpress-systemet20. I motsats till de tidigare metoderna för att förenkla PURE-preparatet17,18,19, i OnePot-metoden uttrycks alla proteiner fortfarande i separata stammar. Detta gör det möjligt för användaren att justera sammansättningen av OnePot PURE-systemet genom att bara utelämna eller lägga till specifika stammar eller justera inokuleringsvolymerna, vilket genererar avhopp PURE-system eller ändra de slutliga proteinkvoterna.

Protokollet som presenteras här ger en detaljerad metod för att skapa OnePot PURE-systemet som beskrivits tidigare20, även om β-mercaptoethanol ersattes med tris (2-karboxytyl)fosfin (TCEP). Dessutom beskrivs två metoder för ribosomrening: traditionell taggfri ribosomrening med hydrofobisk interaktion och sackaroskudde, anpassad från Shimizu et al.15, och Ni-NTA ribosomrening baserad på Wang et al.18 och Ederth et al.21 men väsentligt modifierad. Den senare metoden underlättar ytterligare beredningen av PURE-systemet och gör den tillgänglig för fler laboratorier, eftersom endast standard laboratorieutrustning krävs.

Det experimentella protokollet sammanfattar beredningen av ett mångsidigt PURE-cellfritt TX-TL-system för att tillhandahålla en enkel, tunable, kostnadseffektiv cellfri plattform, som kan förberedas med standard laboratorieutrustning inom en vecka. Förutom att införa standard PURE-kompositionen anger vi hur och var den kan justeras, med ett primärt fokus på kritiska steg i protokollet för att säkerställa systemets funktionalitet.

Protocol

OBS: Detta protokoll beskriver beredningen av cellfria TX-TL-system från rekombinanta komponenter. För enkelhetens skull är arbetet uppdelat i fem delar. Den första delen beskriver förberedelsesteg, vilket bör göras innan protokollet startas. Den andra delen beskriver beredningen av OnePot-proteinlösningen. Den tredje delen beskriver ribosomreningsningar, den fjärde delen beskriver beredningen av energilösningen och den sista delen ger en handbok för att ställa in en PURE-reaktion. För enkelhetens skull är protokollen indelade i dagar och sammanfattas i dagliga scheman i tabell 1. Efter schemat kan hela systemet förberedas på 1 vecka av en person.

1. Preliminärt arbete

  1. Förbered bakteriekulturmedierna och medietillskotten enligt beskrivningen i tilläggstabell 1. Förbered och sterilisera de material som krävs, inklusive pipettspetsar, 96 djupbrunnplattor.
  2. Stamberedning
    1. Omvandla de uttrycksstammar som anges i tabell 2 med motsvarande uttrycksvektorer med hjälp av värmechockmetoden.
      1. Tillsätt renad plasmid till de kemiskt kompetenta bakterierna och inkubera på is i 20-30 min.
      2. Placera blandningen vid 42 °C i 30 s (värmechock) och lägg den sedan tillbaka på is i 2 minuter.
      3. Pipettera 20 μL av bakterierna direkt på agarplattor som innehåller ampicillin (AMP) och inkubera vid 37 °C över natten. Förvara plattorna vid 4 °C i upp till 1 vecka.
      4. Inokulera 3 ml LB-media som innehåller AMP med en enda koloni av bakterier från agarplattorna. Inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min över natten.
      5. Blanda 250 μL av odlingen med 250 μL 50% (v/v) glycerol och förvara vid -80 °C.
        OBS: För snabbare beredning i framtiden, lagra stammarna i en 96-brunnsplatta samt glycerol lager.
    2. Bekräfta alla vektoromvandningar genom koloni PCR och sekvensering. Sekvens genen, promotorregionen och ribosombindningsstället.
  3. Uttryckstest
    1. Inokulera 300 μL LB-medium innehållande AMP med cirka 1 μL av de beredda glycerollagren i en djupbrunnstallrik på 1,3 ml. Försegla plattan med ett membran som andas och inkubera sedan vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min över natten.
      OBS: Alla uttryck görs separat vid denna tidpunkt.
    2. Inokulera 300 μL färska LB-medier som innehåller AMP med 1 μL av de nattliga kulturerna. Inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min över natten. Efter 2 h, inducera cellerna med 100 μM Isopropyl β-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) och växa i ytterligare 3 timmar.
    3. Blanda 10 μL av kulturen med 10 μL 2x Laemmli buffert och värm till 95 °C i 10 min. Snurra proverna i 1 min med en bordscentrifuger och lasta 10 μL av supernatanten på en PAGE-gel. Kör gelén i Tris/Glycine/SDS buffert vid 200 V i 30 min. Skölj det väl med avjoniserat vatten. Täck gelén med en Coomassie proteinfläck och inkubera i 1 h. Avstå gelén i vatten vid behov (representativa resultat för uttryckstestet i figur 1).
      OBS: Använd gradient (4%-15% eller 4%-20%) PAGE geler för att uppnå en bra separation.
  4. Restaurering och rengöring av IMAC Sepharose harts
    1. Förberedelse av pelare.
      1. Blanda Sepharose-hartset väl genom att virvla.
      2. Pipettera den erforderliga mängden harts i en tom gravitationsflödeskolonn.
        OBS: Mängden harts som krävs varierar mellan his-ribosomrening och proteinrening och specificeras i respektive avsnitt.
      3. Tvätta hartset med 30 ml avjoniserat vatten.
      4. Fortsätt med kolumnreladdning enligt avsnitt 1.4.4.
        OBS: Låt alltid all vätska passera genom kolonnen innan du fortsätter med nästa steg. Se dock till att kolonnen aldrig blir torr. När du kör någon vätska genom kolonnen, se till att stoppa flödet eller fortsätt till nästa steg så snart vätskan når hartset.
    2. Återställning.
      1. Tvätta kolonnen med 30 ml avjoniserat vatten.
      2. Applicera 10 ml 0,2 M EDTA och 0,5 M NaCl-lösning.
      3. Tillsätt 30 ml av en 0,5 M NaCl-lösning.
      4. Tvätta kolonnen med 50 ml avjoniserat vatten.
      5. Förvara i 20% (v/v) etanol vid 4 °C eller fortsätt med nästa steg.
    3. Rengöring.
      VARNING: Använd skyddsutrustning.
      1. Tvätta kolonnen med 30 ml 0,5 M NaOH.
      2. Tvätta kolonnen med 30 ml avjoniserat vatten.
      3. Tvätta kolonnen med 30 ml 0,1 M ättiksyra.
      4. Tvätta kolonnen med 30 ml avjoniserat vatten.
      5. Tvätta kolonnen med 30 ml 70% (v/v) etanol.
      6. Tvätta kolonnen med 50 ml avjoniserat vatten.
      7. Förvara i 20% (v/v) etanol vid 4 °C eller fortsätt med nästa steg.
    4. Laddas om.
      1. Tillsätt 10 ml 0,1 M nickelsulfatlösning till kolonnen.
        VARNING: Nickelsulfat är giftigt. Nickelsulfatavfall måste kasseras med de försiktighetsåtgärder som anges av leverantören.
      2. Tvätta kolonnen med 50 ml avjoniserat vatten.
      3. Förvara i 20% (v/v)) etanol vid 4 °C eller fortsätt med kolonnkvilibration.
        OBS: Om kolonnen förvaras i etanol mellan stegen, se till att ta bort alla spår av etanol genom att tvätta kolonnen med vatten.

2. OnePot proteinlösning uttryck och rening

OBS: Protokollet består av tre delar indelade i dagar (figur 2). Ett idealiskt beredningsförfarande producerar 1,5 ml 13,5 mg/ml OnePot-proteinlösning, vilket motsvarar mer än tusen 10 μL PURE-reaktioner. Mängden och den idealiska koncentrationen av lösningen varierar dock från parti till parti. Erfarna användare kan utföra flera OnePot PURE-förberedelser åt gången.

Dag 1:

  1. Förbered bakteriekulturmedier och medietillskott enligt beskrivningen i tilläggstabell 1.
  2. Förbered och sterilisera de material som krävs, inklusive pipettspetsar, två 96 djupbrunnplattor och en 1 L förbryllad Erlenmeyerkolv.
  3. Upprätta buffertar och tillägg enligt beskrivningen i tilläggstabell 2. Filtrera sterilisera alla buffertar med hjälp av flaskfilter (0,45 μm) och förvara dem vid 4 °C. Komplettera alla buffertar med 1 mM TCEP precis före användning, om inget annat anges.
  4. Använd 2 ml sefarosharts för OnePot-proteinrening. Förbered kolumnen enligt beskrivningen i avsnitt 1.4.
  5. För att förbereda startkulturerna, kombinera 20 ml LB-media med 20 μL AMP. Tillsätt 300 μL av mediet i 35 brunnar i en steril 96, 1,3 ml djupbrunnstallrik. Inokulera var och en av dem med sin respektive stam, förutom töjningsfaktor termo instabil (EF-Tu), och försegla plattan med ett andningsbart membran.
    OBS: Inokulera plattan med en 96-brunnsreplikator (se Materialtabell). Brunnsvolymen på djupbrunnplattan och startkulturens volym är väsentliga. Större medievolymer eller mindre brunnsvolymer kommer att leda till en annan bakterietäthet på grund av inkonsekvenser i inkonsekvenser.
  6. För EF-Tu-kulturen, inokulera 3 ml LB-media i ett 14 ml kulturrör med en snap cap. En enda 3 ml kultur för EF-Tu är tillräcklig för en OnePot uttryckskultur.
  7. Inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min över natten.

Dag 2:
OBS: Utför alla steg i rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Överför 500 ml LB-media och 500 μL AMP till den sterila förbryllade kolven.
  2. Inokulera OnePot PURE-kulturen med 1675 μL EF-Tu-kulturen och 55 μL av var och en av kulturerna från djupbrunnstallriken(tabell 2).
    OBS: Under detta steg kan den totala proteinsammansättningen justeras genom att justera inokuleringsförhållandena. Se till att den totala inokuleringsvolymen förblir konstant vid 3,6 ml.
    VALFRITT: För att bekräfta att alla stammar har vuxit över natten, mät den optiska densiteten hos nattkulturerna till 600 nM (OD600)i en 96-brunnsplatta med en plattläsare. Använd en utspädning på 10x för mätning av optisk densitet.
  3. Inkubera kulturen i 2 timmar vid 37 °C med en skakning på 260 varv/min, eller tills kulturens OD600 når 0,2-0,3.
  4. Inducera kulturen med 500 μL 0,1 mM IPTG och växa i ytterligare 3 timmar.
  5. Skörda cellerna genom centrifugering vid 4 °C och 3220 x g i 10 minuter och förvara cellpelleten vid -80 °C tills vidare.
    OBS: För att optimera tidpunkten, förbered den energilösning som beskrivs i avsnitt 4 under inkubationstiden dag 2(tabell 1).

Dag 3:

  1. Mät de mängder buffertar som behövs för reningen som beskrivs i stegen nedan och tillsätt TCEP till dem alla enligt tilläggstabell 2. Förvara de återstående buffertarna utan TCEP vid 4 °C för framtida reningar.
  2. Balansera den laddade kolumnen (avsnitt 2.4) med 30 ml buffert A. När 25 ml buffert A har passerat stänger du kolumnen nedifrån. Parallellt fortsätter du med steg 2.15-2.17.
  3. Tina cellerna och använd en serologisk pipett för att återanvända cellpelleten i 7,5 ml buffert A.
  4. Lyse cellerna med hjälp av en 130-watt sond sonicator (se Tabell över material, sondspetsdiameter: 6 mm) med följande parametrar: 4 x 20 s puls på, 20 s puls av, 70% amplitud. Om ultraljudsbehandlingen lyckas blir lösningen mörkare (bild 2).
    OBS: Se till att hålla cellerna på is under ultraljudsbehandling. Placera sonden tillräckligt djupt i lösningen utan att vidröra röret. Om en stor mängd skum genereras dämpas energiöverföringen. Låt i så fall skummet sätta sig, sänka sonden djupare in i lösningen och förlänga ultraljudsbehandlingstiden.
  5. Ta bort cellskrotet genom centrifugering vid 21130 x g i 20 min vid 4 °C omedelbart efter ultraljudsbehandling. Håll lysat på is.
  6. Lägg till supernatanten i den ekvilibrerade kolumnen. Stäng kolonnen uppifrån och se till att det inte finns något läckage. Inkubera kolonnen i 3 h vid 4 °C under rotation med hjälp av en rörrotator.
  7. Elute obundna komponenter från kolonnen och tvätta med 25 ml buffert A.
  8. Tvätta kolonnen med 25 ml 25 mM imidazolbuffert (23,95 ml buffert A och 1,25 ml buffert B).
  9. Elute proteinerna med 5 ml 450 mM imidazolbuffert (0,5 ml buffert A och 4,5 ml buffert B). Håll de eluterade proteinerna på is hela tiden.
  10. Späd eluatet med 25 ml HT-buffert, håll blandningen på is. Tillsätt 15 ml till ett 15 ml centrifugalfilter och koncentrera dig till en volym av 1,5 ml. Tillsätt de återstående 15 ml till filtret med den koncentrerade lösningen och koncentrera dig till 1,5 ml igen.
  11. Tillsätt 10 ml HT-buffert till det koncentrerade provet och koncentrera till 1 ml. Tillsätt lika mycket lagerbuffert B och förvara vid -80 °C tills vidare.
    OBS: En omgång utbyte/koncentration tar ca 60 min spinning vid 3220 x g vid 4 °C.
  12. Återställ kolumnen enligt avsnitt 1.4 under buffertutbytet.

Dag 4:

  1. Mät proteinkoncentrationen med hjälp av Bradford-analysen enligt leverantörens beskrivna. Koncentrera provet med ett 0,5 ml 3 kDa cutoff centrifugalfilter till 20 mg/ml.
    OBS: Späd ut proteinlösningen 25 gånger eller 50 gånger före koncentrationsmätningarna för att undvika övermättnad av Bradford-analysen.
  2. För att fastställa den ideala proteinkoncentrationen, utför ett uttryckstest i detta skede (avsnitt 5.2) med olika koncentrationer av proteinlösningen. För att utföra titreringen, håll den totala volymen av lösningen konstant och pipetten OnePot proteinlösningen, inklusive lagerbuffert B, vid fem olika förhållanden(kompletterande tabell 7).
  3. Kontrollera OnePot PURE-proteinkompositionen med SDS-PAGE (bild 3A). Späd ut 2,5 μL av provet med 7,5 μL vatten, blanda med 10 μL 2x Laemmli-buffert och lasta sedan 5 μL och 2,5 μL av proverna till gelén. Kör SDS-PAGE enligt avsnitt 1.3.3.
  4. Aliquot proteinlösningen i 50 μL alikvoter efter att ha verifierat uttrycket och justerat koncentrationen. Förvara OnePot PURE-proteinlösningen vid -80 °C tills vidare användning.
    OBS: Om en proteinkomponent misstänks inte finnas eller finns i en lägre koncentration än förväntat i OnePot PURE, utför följande steg.
  5. Kontrollera om respektive stams nattkultur har vuxit i jämförbar takt med de andra kulturerna genom att utföra optiska densitetsmätningar (OD600)av alla kulturer.
  6. Utför ytterligare ett uttryckstest av den specifika stammen för att verifiera uttrycket av det misstänkta proteinet.

3. Ribosomlösning

OBS: Två olika ribosomreningsstrategier införs, en för hexahistidinmärkt och en för icke-taggade ribosomer. Den stora fördelen med reningsmetoden med hisrening på en standard affinitet Ni-NTA gravitation flöde kolumn är att reningen är enkel, snabb och inte kräver ytterligare laboratorieutrustning, såsom ett FPLC-system och en ultracentrifuge. Proteinproduktionskapaciteten i OnePot PURE-reaktioner är dock cirka en tredjedel jämfört med taggfria ribosomer. Välj därför metoden för ribosomproduktion baserat på om ett högt utbyte är viktigt för den givna applikationen.

  1. His-märkt ribosom rening
    OBS: Detta protokoll använder E. coli RB1-stammen, en gåva från professor Wang (Columbia University, USA)18. Denna stam har en genomisk insättning av en hexahistidin tagg på C ändstationen av 50S ribosomal protein (L7/L12), vilket möjliggör rening med hjälp av en Ni-NTA gravitation-flöde kolumn. Den vanliga avkastningen är cirka 0,5 ml 3,45 μM ribosomer, vilket är tillräckligt för mer än femhundra 10 μL PURE-reaktioner.

Dag 1:

  1. Förbered bakteriekulturmedier och medietillskott enligt beskrivningen i tilläggstabell 1.
  2. Förbered och sterilisera de material som krävs, inklusive pipettspetsar, en 5 L Erlenmeyerkolv och en 100 ml Erlenmeyerkolv.
  3. Upprätta buffertar och tillägg enligt beskrivningen i tilläggstabell 2. Filtrera sterilisera alla buffertar med hjälp av flaskfilter (0,45 μm) och förvara dem vid 4 °C.

Dag 2:

  1. Pipettera 5 ml harts till en pelare och förbered kolonnen enligt punkt 1.4.
    OBS: På grund av hartsets högre volym tar restaureringen och reningen betydligt längre tid. Använd en annan kolumn för ribosomrening för att undvika korskontaminering och rengör den noggrant före reningen.
  2. Förbered en nattlig kultur av E. coli RB1-stammen genom att inokurera 35 ml LB-media i en 100 mL Erlenmeyer-kolv. Inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min.

Dag 3:
OBS: Utför alla steg i rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Tillsätt 2 L LB-media i en 5 L steril kolv, inokulera med 12 ml över nattens kultur och inkubera sedan i 3-4 timmar vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min.
    OBS: Alternativt, utföra bakteriell odling i 4 x 500 ml kulturer i 1 L förbryllade flaskor.
  2. Pellet cellerna genom centrifugering i 10 min vid 3220 x g och 4 °C. Förvara vid -80 °C tills vidare användning.

Dag 4:

  1. Balansera den kolumn som bereds i steg 3.1.4. med 30 ml lysbuffert.
  2. Återanvänd pelleten i 20 ml lysbuffert med hjälp av en serologisk pipett.
  3. Lyse cellerna med en 130-watt sond sonicator (se Tabell över material, sondspetsdiameter: 6 mm) på is med följande parametrar: 11 x 20 s puls på; 20 s puls av, 70% amplitud (se steg 2.16 för procedurdetaljer).
  4. Omedelbart efter ultraljudsbehandling, ta bort cellrester genom centrifugering i 20 min vid 21130 x g vid 4 °C. Håll lysat på is.
  5. Ladda supernatanten till kolumnerna och låt den passera igenom.
  6. Tvätta kolonnen med följande blandningar av lys- och elutionsbuffertar.
    1. Tvätt 0: Använd 30 ml lysbuffert.
    2. Tvätt 1: använd 30 ml 5 mM imidazol (29 ml lysbuffert, 1 ml elutionsbuffert).
    3. Tvätt 2: använd 60 ml 25 mM imidazol (50 ml lysbuffert, 10 ml elutionsbuffert).
    4. Tvätt 3: använd 30 ml 40 mM imidazol (22 ml lysbuffert, 8 ml elutionsbuffert).
    5. Tvätt 4: använd 30 ml 60 mM imidazol (18 ml lysbuffert, 12 ml elutionsbuffert).
  7. Elute ribosomerna med 7,5 ml elutionbufferten. Håll de eluterade proteinerna på is hela tiden.
  8. Tillsätt 22 μL ren β-mercaptoethanol till 45 ml ribosombuffert.
    VARNING: β-mercaptoethanol är giftigt. Vidta säkerhetsåtgärder och arbeta i en rökhuv.
  9. Tillsätt eluatet till ett 15 ml centrifugalfilter och koncentrera till 1 ml.
  10. Tillsätt 15 ml ribosombuffert till det koncentrerade provet och koncentrera dig igen till 1 ml.
    OBS: Upprepa föregående steg två gånger.
  11. Förvara vid -80 °C tills vidare användning.
    OBS: En omgång utbyte/koncentration tar ca 60 min centrifugering vid 3220 x g vid 4 °C.
  12. Återställ kolumnen enligt avsnitt 1.4 under buffertutbytet.

Dag 5:

  1. Bestäm ribosomkoncentrationen genom att mäta absorbansen vid 260 nM av ett prov utspädd 1:100 i ribosombuffert. Absorbansvärdet 10 av den utspädda lösningen motsvarar 23 μM outspädd lösning enligt tidigare beskrivna16.
  2. Implementera en slutlig lagerkoncentration på 3,45 μM. För att justera koncentrationen, späd ribosomerna med ribosombuffert eller koncentrera dem ytterligare genom centrifugering vid 14000 x g i ett 3 kDa 0,5 ml centrifugalfilter vid 4 °C.
    OBS: För att uppnå ett optimalt systemuttryck, utför en ribosomkoncentrationstitrering (avsnitt 5.2, tilläggstabell 7).
  3. Kontrollera ribosomkompositionen med SDS-PAGE(bild 3A)enligt punkt 1.3.3. Späd 2,5 μL av provet med 7,5 μL vatten, blanda med 10 μL 2x Laemmli-buffert och lasta sedan 5 μL och 2,5 μL av proverna på gelén.

  1. Taggfri ribosomrening
    OBS: Taggfri ribosomrening utförs med hjälp av ett FPLC-system(Table of Materials) och baseras på hydrofobisk interaktionskromatografi med 2 x 5 ml Butylkolumner(Tabell över material). Även om ribosomer kan renas från vilken stam som helst, är det fördelaktigt att använda E. coli A19 (E. coli Genetic Resources at Yale CGSC) på grund av dess RNase I borttagning22. Utför reningen vid 4 °C i antingen ett kylrum eller ett kylskåp. Den vanliga avkastningen är cirka 0,5 ml 10 μM ribosomer, vilket motsvarar mer än femhundra 10 μL PURE-reaktioner.

Dag 1:

  1. Förbered bakteriekulturmedier och medietillskott enligt beskrivningen i tilläggstabell 1.
  2. Förbered och sterilisera de material som krävs, inklusive pipettspetsar, 5 L Erlenmeyerkolv och 100 ml Erlenmeyerkolv.
  3. Upprätta buffertar och tillägg enligt beskrivningen i tilläggstabell 2. Filtrera sterilisera alla buffertar med hjälp av flaskfilter (0,45 μm) och förvara dem vid 4 °C.

Dag 2:

  1. För att förbereda en nattkultur av E. coli A19-stammen, inokulera 35 ml LB-media i en 100 ml Erlenmeyerkolv. Inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min.

Dag 3:

  1. Överför 2 L LB-media till den 5 L sterila förbrytna kolven, inokulera med 30 ml av nattkulturen och inkubera sedan i 3-4 timmar vid 37 °C medan du skakar vid 200 varv/min.
  2. Pellet cellerna genom centrifugering vid 4000 x g i 15 min vid 4 °C. Återanvänd pelleten i 25 ml suspensionsbuffert och förvara vid -80 °C tills vidare.

Dag 4:

  1. Utför steg 3.2.8-3.2.12 parallellt med steg 3.2.13-3.2.19.
  2. Tina och lysera cellerna med hjälp av en 130-wattssond sonicator (se Tabell över material och sondspetsdiameter: 6 mm) på is med följande parametrar: 12 x 20 s puls på; 20 s puls av, 70% amplitud (se steg 2.16 procedurdetaljer).
  3. Avlägsna omedelbart cellskräpet genom centrifugering vid 20000 x g i 20 min vid 4 °C.
  4. Aspirera supernatanten och mät volymen. Tillsätt en lika stor mängd suspensionsbuffert (högt salt) för att justera den slutliga koncentrationen av ammoniumsulfat till 1,5 M och blanda väl.
  5. Ta bort fällningen genom centrifugering vid 20000 x g i 20 min vid 4 °C.
  6. Filtrera supernatanten med hjälp av ett 0,45 μm polyetersulfonmembransprutfilter före FPLC-rening och samla filtratet i en 100 ml glasflaska. Håll supernatanten vid 4 °C hela tiden.
  7. Ställ in FPLC-systemet för hydrofobisk interaktionskromatografirening med en dubbel Butylkolonn (2 x 5 ml) enligt följande. För den här inställningen refererar en kolumnvolym (CV) till en volym på 10 ml.
  8. Tre inlopp kommer att behövas: två som buffertlinjer och en som exempellinje. På grund av renarens standardinställningar är det bekvämt att välja linjerna A1 och B1 för buffert C respektive buffert D och linje A2 som exempellinje. Applicera ett standardflöde på 4 ml/min, med undantag för pumptvättar (10 ml/min) eller om inget annat anges.
    OBS: Eftersom TCEP är ett kostsamt reagens lägger du till motsvarande belopp till buffertarna C och D först efter jämviktssteget.
  9. Utför en systempumptvätt i 20% (v/v)) etanol för att rengöra systemet och avlägsna potentiell förorening från tidigare reningar. Ställ in ett flödeshastighet på 0,2 mL/min manuellt och montera kolonnen. Stoppa flödet.
  10. Utför en systempumptvätt med vatten. Tvätta kolonnen med 3 CV vatten.
  11. Jämvikt: placera inloppen A1 och A2 i buffert C och inlopp B1 i buffert D utan TCEP. Utför en pumptvätt och balansera kolonnen med 4 CV buffert C.
  12. Lägg till TCEP i buffertarna C och D.
  13. Förbered 15 ml rör eller rensa runda fraktionssamlarrör till fraktionssamlaren för att samla 4-5 ml elutionsfraktioner.
  14. Lastning: Placera inloppet A2 i flaskan med det filtrerade provet. Läs in cirka 90 % av exempelvolymen på kolumnen. Späd ut provet med 20 ml TCEP-innehållande buffert C och lasta 10 ml av provet på kolonnen. Upprepa utspädningssteget minst två gånger och ladda så mycket prov på kolonnen som möjligt. Det är viktigt att se till att ingen luft sugs in i maskinen.
  15. Tvätt steg 1: tvätta med 3 CV buffert C för att ta bort de obundna komponenterna.
  16. Tvätt steg 2: tvätta med 5 CV av 80% buffert C och 20% buffert D.
  17. Elution: elutera produkten genom att applicera 50% av buffert C och 50% av buffert D, med en total elutionsvolym på 5 CV. Samla in denna fraktion i uppsamlarrören.
  18. Tvätt steg 3: Elute alla starkt interagerande föroreningar med 100% buffert D med en total volym på 5 CV.
  19. Analysera provfraktionens absorptionsspektrum vid 260 eller 280 nM (figur 4). Den första toppen visar de icke-absorberade proteinerna som eluteras under lastning och det första tvättsteget; den andra toppen visar föroreningar som har eluterats under det andra tvättsteget. Den tredje toppen övervakar slutprodukten, och den sista toppen visar de starkt interagerande föroreningarna. Poola alla provfraktioner som motsvarar den tredje toppen för vidare bearbetning. Håll de eluterade proteinerna på is hela tiden.
  20. Lägg försiktigt över den återvunna fraktionen på 15 ml av kuddebufferten i fyra ultracentrifugationsrör med polykarbonat. Tillsätt högst 15 ml av provet till 15 ml av kuddbufferten. Se till att balansera rörets vikt väl. Pellet ribosomerna genom ultracentrifugation vid 100000 x g vid 4 °C i 16 timmar.
    OBS: Se till att det inte finns några sprickor i ultracentrifugeringsrören.
  21. Rengör och återställ kolumnen enligt följande. Ett flöde på 5 ml/min fungerar bra. Placera alla inlopp i vattnet och utför en pumptvätt. Tvätta kolonnen med 2 CV vatten.
    1. Placera inloppet i en 0,5 M NaOH-lösning, utför en pumptvätt och tvätta sedan kolonnen med 3 CV NaOH.
    2. Placera inloppet i vatten, utför en pumptvätt och tvätta sedan kolonnen i 2 CV vatten.
    3. Placera inloppet till en 0,1 M ättiksyralösning, utför en pumptvätt och tvätta sedan kolonnen med 3 CV ättiksyralösning.
    4. Pumpa och tvätta kolonnen med 2 CV vatten.
    5. Placera alla inlopp i 20% (v/v)) etanol, utför ett pumptvättsteg och förvara kolonnen i 20% (v/v)) etanol genom att tvätta den med 3 CV av en 20% (v/v)) etanollösning.
      OBS: Se till att systemet aldrig torkar eller suger in luft. Applicera aldrig buffert direkt på etanol eller etanol på buffert. Tillsätt alltid ett vattentvättsteg däremellan, eftersom det annars finns risk för fällningar som täpper till kolonnen. Se till att lägga till tillräckligt med provsamlingsrör.

Dag 5:

  1. Kassera supernatanten och tvätta varje pellet utan att störa den genomskinliga pelleten med 0,5 ml iskall ribosombuffert. Upprepa det här steget två gånger.
  2. Återsuspend var och en av de klara pelletsen i 100 μL ribosombuffert på is med hjälp av en magnetisk omrörning (3 mM diameter, 10 mM längd) på en magnetisk omrörare med lägsta möjliga hastighet. Samla upp de återanvända ribosomerna och tvätta rören med ytterligare 50 μL ribosombuffert.
    OBS: Den genomskinliga pelleten är svår att se. Tvätta därför försiktigt pelleten från rörets sidor.
  3. Bestäm ribosomkoncentrationen genom att mäta absorbansen vid 260 nM av provet utspädd med ett förhållande av 1:100 i ribosombuffert. En absorbans på 10 av den utspädda lösningen motsvarar 23 μM outspädd lösning enligt beskrivningen16.
  4. Implementera en slutlig lagerkoncentration på 10 μM. För att justera koncentrationen, späd ribosomerna med ribosombuffert eller koncentrera dem ytterligare genom centrifugering vid 14000 x g i ett 3 kDa centrifugalfilter vid 4 °C.
    OBS: För att uppnå ett optimalt systemuttryck, utför ribosomtitrering (avsnitt 5.2, tilläggstabell 7).
  5. Kontrollera ribosomkompositionen med SDS-PAGE (figur 3A) enligt punkt 1.3.3. Späd ut 2,5 μL av provet med 7,5 μL vatten, blanda med 10 μL 2x Laemmli-buffert och lasta sedan 5 μL och 2,5 μL av proverna till gelén.

4. Energilösning

OBS: Kompositionen för den 2,5x energilösning som introduceras här är ett exempel på en lösning som fungerade bra för en vanlig TX-TL-reaktion. För att optimera tidpunkten, förbered energilösningen under dag 2. Beredningen av aminosyralösningen förklaras i detalj, följt av det slutliga förberedelseförfarandet.

  1. Aminosyra lösning
    OBS: Förbered aminosyralösningen i bulk. Att förbereda den mängd aminosyralagerlösningar som krävs för en slutlig volym på minst 2000 μL kommer att minska vägningsfelet för de annars mycket små mängderna. Den totala koncentrationen av aminosyralösningen begränsas av aminosyrornas löslighet och respektive stamlösningskoncentrationer. För standard PURE-systemet, förbered en lösning med en slutlig koncentration på 3,25 mM. Använd beräkningstabellen för aminosyralösning (tilläggstabell 3) som mall. Använd cystein i saltformen för att säkerställa tillräcklig löslighet. Undvik att använda KOH-baserade aminosyrapreparatmetoder. Det är möjligt att direkt väga de exakta mängderna aminosyror i den slutliga aminosyralösningen utan att förbereda stamlösning för alla aminosyror. Detta är dock mer utmanande och mindre exakt.
    1. Förbered lagerlösningar för varje aminosyra enligt beskrivningen i tilläggstabell 3,med undantag för tyrosin.
      OBS: På grund av de olika solubilities av aminosyrorna i vatten, skiljer sig respektive föreslagna koncentrationer av stamlösningen.
    2. Minimal massa [mg] ger den ungefärliga minsta massa som krävs för att erhålla en tillräcklig mängd lagerlösning för målvolymen, som referens.
      OBS: Den minimala massan beräknas med ett överskott på 10%.
    3. För en enklare förberedelse av lösningarna, väg inte den exakta mängden aminosyra, utan istället, för massan till hands, justera mängden vatten för att uppnå önskad koncentration. Beräkna mängden avjoniserat vatten (vatten att tillsätta [μL]) som behövs, baserat på den faktiska massa som fylls i (ljusgula celler) och önskad koncentration med hjälp av kalkylbladet i tilläggstabell 3.
    4. Solubilisera aminosyrans lagerlösningar genom att virvla tills allt fällning har löst sig. De enskilda aminosyra lagerlösningarna kan lagras vid -20 °C i flera veckor.
      OBS: Vissa aminosyror är svåra att lösa upp i vatten; processen kan ta lite tid.
    5. Väg den exakta mängden tyrosin som krävs för att erhålla en slutlig koncentration på 3,25 mM direkt i röret för aminosyralösningen.
      OBS: Tyrosin är mycket svårt att lösa upp i vatten. Lägg till det direkt istället för att förbereda en lagerlösning.
    6. Tillsätt motsvarande mängder aminosyralagerlösningar och vatten som anges i den slutliga volymen för att tillsätta [μL] kolonn (ljusblå celler) och virvla lösningen väl. Förvara den färdiga aminosyralösningen vid -80 °C tills den används vidare.
  2. Beredning av energilösningen
    OBS: Totalt innehåller 2,5x energilösningen 0,75 mM av varje aminosyra, 29,5 mM magnesiumacetat, 250 mM kaliumgluktamat, 5 mM ATP och GTP vardera, 2,5 mM CTP, UTP respektive TCEP, respektive 8,75 mg/ml tRNA från E. M. 5 mM spermidin och 125 mM HEPES. Förstagångsanvändare förbereder energilösningen i små partier om 200 μL. Förvara de enskilda lösningar som beretts enligt tilläggstabell 4 vid -20 °C eller -80 °C för senare användning.
    1. Tina upp alla vattenlösningar som nämns i tilläggstabell 5 på is.
    2. Under tiden bereder du lagerlösningarna för de återstående komponenterna som anges i tilläggstabell 4. Håll alla lösningar på is efter beredning.
      OBS: Tillsätt 500 μL RNase- och DNase-fritt vatten direkt till injektionsflaskan för att lösa upp de frystorkade tRNA. Blanda väl genom skonsam virvel; begränsa pipettering för att undvika att införa RNases.
    3. Tillsätt de beräknade volymerna (tilläggstabell 5) av lagerlösningar och vatten och blanda väl med en virvel. Håll lösningen på is hela tiden.
    4. Mät lösningens pH genom pipettering 1 μL på en pH-remsa för att säkerställa att lösningens pH-värdet är neutralt.
    5. Aliquot energilösningen vid 50-100 μL per rör på is och lagra vid -80 °C tills vidare användning. Under aliquoting, virvla huvudlagret ofta för att förhindra att komponenterna fälls ut.
      OBS: Gör eventuellt en aktivitetsanalys av den nytillverkade energilösningen mot kommersiella energilösningar, t.ex. lösning A i PURExpress. Om en betydligt lägre prestanda hos systemet med energilösningen observeras kan det vara fördelaktigt att optimera jonkoncentrationerna, särskilt magnesiumjoner, genom titrering (5-20 mM).

5. OnePot REN reaktion

  1. DNA-mall
    OBS: Proteiner kodade nedströms T7-promotorn kan uttryckas i PURE från antingen linjärt eller cirkulärt DNA. Genom att generera en linjär DNA-mall med hjälp av förlängning PCR kan tråkiga kloningssteg utelämnas. De linjära mallarna för denna studie genererades av PCR enligt beskrivningen nedan, med hjälp av ett DNA-polymeras med hög återgivning (Table of Materials). Primersekvenser, smälttemperaturer och termocykelns inställningar som används i denna studie anges i tilläggstabell 6. Utarbetandet av DNA-mallen ingår inte i det dagliga schemat.
    1. Ställ in en PCR-reaktion enligt polymerasleverantörens rekommenderas.
      OBS: Optimerade parametrar för ett DNA-polymeras med hög återgivning(Materialförteckning)anges i tilläggstabell 6.
    2. Förstärka målgenen (t.ex. eGFP) som en linjär mall från en plasmid eller genom med hjälp av genspecifika primers (500 nM) (för parametrarna, se kompletterande tabell 6).
    3. Förstärkningen genererar korta tillägg för att ge glödgningssekvenser för följande pcr-steg för tillägg.
    4. Kontrollera ampliconen på en agarosegel för korrekt storlek och renhet.
    5. Använd det förstärkta DNA:t som mall för de efterföljande tilläggsstegen. Ställ in en reaktion på minst 50 μL.
    6. Kör 10 PCR-förstärkningscykler med förlängningsprimrar (2,5 nM). Efter att ha slutfört förstärkningscyklerna, tillsätt omedelbart de slutliga primersna (500 nM) till samma reaktion och kör 30 cykler för att förstärka den utökade PCR-produkten. Hitta smälttemperaturer och primersekvenser i tilläggstabell 6.
    7. Rena DNA-fragmenten med hjälp av ett DNA-reningskit och elute DNA i nukleasfritt vatten istället för EDTA som innehåller elutionbuffert.
    8. Kontrollera den linjära mallen på en agarosegel för korrekt storlek och renhet.
    9. Mät DNA-koncentrationen i ng/μL med hjälp av en UV-Vis spektrofotometer.
  2. Ställa in PURE-reaktionen
    OBS: Den slutliga reaktionskompositionen är 1x energilösning, taggfria ribosomer eller his-tag ribosomer, OnePot PURE-proteiner och DNA-mall. Reaktionsvolymförhållandet omfattar 40% energilösning, 30% protein och ribosomlösning och 30% DNA och vatten. Typiska reaktionsvolymer varierar mellan 5 μL och 25 μL. Kvantifiera uttrycket av ett fluorescerande protein kontinuerligt på en plattläsare. Använd en grön lys in vitro Translation Labeling System, som innehåller fluorescerande märkta Lysinrester i nyligen syntetiserade proteiner, för att verifiera uttrycket av icke-fluorescerande proteiner på en SDS-PAGE-gel. En exempelreaktionsmall ges i Tilläggstabell 7 för att hjälpa till att etablera en REN cellfri uttrycksreaktion. Celler i gult anger värden för användarinmatning, och celler i orange indikerar att ytterligare reagenser eventuellt ska läggas till reaktionen. Håll komponenternas volymförhållanden exakta för att säkerställa rätt jonbalans. Till exempel, för att uppnå en högre proteinkoncentration, öka OnePot-proteinlösningskoncentrationen; Öka dock inte volymen proteinlösning som tillsätts till reaktionen.
    1. Fyll i koncentrationen [ng/μL] och längden [baspar] av DNA i motsvarande gula celler i kalkylbladet. Använd 2-10 nM DNA för reaktionen.
    2. Fyll i önskad total reaktionsvolym i μL.
    3. Ta ut de reagenser som krävs från frysen och tina dem på is.
      OBS: Återfrysning av komponenterna är möjlig utan att funktionaliteten försämras. Minimera dock antalet frys-tina cykler och tidsproverna lagras på is så mycket som möjligt.
    4. Pipettera de beräknade mängderna vatten, DNA och energilösning på ena sidan av PCR-röret eller ett hörn av en brunn på 384-brunnsplattan. Tillsätt den erforderliga mängden ytterligare reagens på samma sida. Minimera antalet prover per experiment för att undvika provavdunstning och experimentell starttidsförskjutning.
      OBS: Det är viktigt att hålla energikomponenten fysiskt separerad från proteinkomponenterna för att undvika för tidig förbrukning av energikällorna och lägre utbyten.
    5. Pipettera de beräknade mängderna protein och ribosomlösning till andra sidan av ett PCR-rör eller det motsatta hörnet av 384-brunnsplattan.
      OBS: Använd huvudblandningar när det är möjligt för att minska effekten av pipetteringsfel. Efter inledande testning kan ribosom- och proteinlösningarna blandas och lagras som en lösning.
    6. Snurra under en kort tid (30 s) för att slå samman reaktionskomponenterna. För att förhindra avdunstning under experiment med plattavläsare, tillsätt 35 μL flytande vax och försegla plattan med ett genomskinligt tätningsmedel (se Materialtabell).
    7. Inkubera i minst 3 timmar vid 37 °C.
    8. För avläsning på en plattläsare, mät fluorescensintensiteten vid önskad våglängd var 2:e minut (representativa resultat visas i figur 3B).
    9. Utför följande steg för Green Lys-märkta exempel.
    10. Efter det cellfria uttrycket, inkubera provet med 0,16 μg/μL RNase A i 30 min vid 37 °C för att avlägsna den fluorescerande bakgrunden på Green Lys märkningssats.
      OBS: Använd RNase A, eftersom andra typer av RNases inte tar bort bakgrunden tillräckligt bra.
    11. Visualisera proteinuttrycket genom att köra SDS-PAGE enligt avsnitt 1.3.3. Tvätta den oförstätade gelén försiktigt i avjoniserat vatten och avbilda den på en fluorescerande bildspelare med en excitationsvåglängd på 488 nm.
    12. Därefter färga gelén med konventionella Coomassie färgningsmetoder. För lämpliga parametrar se avsnitt 1.3.3.
      OBS: Utför en titrering av proteinlösningen med rekommenderad ribosomkoncentration och vid behov titrera ribosomer med optimal OnePot-proteinkoncentration efteråt. Använd det kommersiella PURExpress ΔRibosome-kitet som en positiv kontroll. Lösning A, Faktormix och ribosomlösning motsvarar den beredda energin, OnePot-proteinlösningen respektive de renade ribosomerna.

Representative Results

Ovanstående protokoll är utformat för att underlätta upprättandet av PURE-cellfria TX-TL-systemet i alla laboratorier. Protokollet innehåller en detaljerad beskrivning av beredningen av de tre distinkta delarna av PURE-systemet: OnePot-proteinet, ribosomen och energilösningen. Ett detaljerat dagligt schema som optimerar arbetsflödet visas i tabell 1. Arbetsflödet är optimerat för rening av his-märkta ribosomer, och tidsramarna kan skilja sig något om taggfri ribosomrening utförs. Ett preparat ger en tillräcklig mängd PURE för minst femhundra 10 μL reaktioner. Dessutom är de förberedda lösningarna stabila i mer än ett år vid -80 °C och tål flera frys-tina-cykler.

Adekvata överuttrycksnivåer för alla stammar är avgörande för funktionaliteten hos den slutliga proteinlösningen. Figur 1 visar framgångsrik överuttryck i alla 36 enskilda stammar som därefter används för OnePot-proteinpreparatet. Variationen i de över uttryckta proteinernas bandintensiteter inträffade troligen på grund av en förspänning i lastvolymerna på SDS-PAGE-gelen. De förväntade proteinstorlekarna sammanfattas i tabell 2. GlyRS och PheRS består av två underenheter av olika molekylvikter; de återstående 34 proteinerna består av en enda underenhet. Nyckeln till detta protokolls enkelhet och tidseffektivitet är kokulturerings- och samreningssteget (figur 2). OnePot-proteinlösningen framställdes genom att öka förhållandet mellan EF-Tu-stammen med avseende på alla andra uttrycksstammar. Den totala sammansättningen av de slutliga proteinerna analyserades av SDS-PAGE (figur 3A). Från gelerna (körfält 2, 3) märks det att EF-Tu (43,3 kDa) finns i en högre koncentration jämfört med de andra proteinerna, som förväntat. Medan gelén ger en bra första indikation på proteinuttrycksförhållanden, är det svårt att avgöra om och på vilken nivå varje enskilt protein uttrycktes. Därför rekommenderas det starkt att bekräfta överuttryck i varje stam före kokulation, som visas ovan.

E. coli ribosom är en komplex molekylär maskin som består av över 50 enskilda proteinunderenheter23. Ett representativt absorptionsspektrum vid 260 nm för taggfri ribosomrening visas i figur 4. den tredje toppen är karakteristisk för framgångsrik ribosom elution. För båda ribosomreningsmetoderna observerades det förväntade körmönstret på SDS-PAGE-gelen (figur 3A)18. Vi observerade föroreningar för båda reningarna, om än i små mängder (<10%). Noterbart var att olika föroreningar fanns i de taggfria (körfält 5, 6) och His-märkta (körfält 11, 12) ribosomer på grund av variationen i metoden. Som användarreferens ingår även SDS-PAGE-gelerna för de kombinerade systemen (körfälten 8, 9 och 14, 15).

Slutligen jämförs de förberedda systemens prestanda (figur 3) med hjälp av de olika ribosomvarianterna. Tidskurserna för in vitro eGFP-uttryck visar att båda PURE-systemen är funktionella och producerar fluorescerande eGFP. OnePot-proteinlösningen i kombination med his-märkta ribosomer, med hjälp av ribosomkoncentrationen optimerad genom titrering, gav dock endast en tredjedel av uttrycksnivån för den icke-märkta ribosomversionen (figur 3B). Liknande resultat observerades när tre proteiner av olika storlekar uttrycktes och märktes med hjälp av Green Lys tRNA in vitro-märkningssystem (figur 3C). Som ses på fluorescerande gel, fullängdsprodukter uttrycktes framgångsrikt i båda systemen; Emellertid uppnåddes endast omkring halvan av uttrycksnivån med His-tag ribosomsystemet. Förutom fluorescensmärkningen kan de förväntade banden för alla tre proteinerna särskiljas på en Coomassie-betsad gel (figur 3D). Resultaten visar att det introducerade uttryckssystemet, som kan förberedas inom en vecka i ett laboratorium med standardutrustning, kan användas för in vitro-uttryck av proteiner som kodas nedströms T7-promotorn från linjära mallar.

Figure 1
Figur 1: Representativa resultat för överuttryckstestet för alla uttrycksstammar i PURE-systemet. RENA proteinnummer och storlekar sammanfattas i tabell 2. Proteinnummer 21, 24 och 27 är markerade med en stjärna för bättre visualisering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: OnePot proteinrening. Den schematiska skildringen och motsvarande fotografier av alla steg som är involverade i produktionen av OnePot-proteinlösningen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Prestanda hos de beredda systemen med hjälp av de olika ribosomvarianterna. (A) Coomassie blåbetsade SDS-PAGE-geler i OnePot-proteinlösningen (körfält 2, 3), taggfria ribosomer utan proteinlösning (körfält 5, 6) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning Två olika koncentrationer laddades per prov. (B) Jämförelse av eGFP-uttryck av his-märkta ribosomer och taggfria ribosomer. Fluorescensintensiteten hos eGFP-uttrycket in vitro övervakas över tid för en PURE-reaktion med hjälp av taggfria ribosomer (1,8 μM, blå) och hismärkta ribosomer (0,62 μM, röd). Koncentrationerna av den linjära mallen och OnePot proteinlösningen var 4 nM respektive 2 mg/mL. Panelerna (C) och (D) visar SDS-PAGE-gelen av proteiner syntetiserade i OnePot med taggfria (1,8 μM, blå, körfält 3, 4, 5) och his-tag ribosomer (0,62 μM, röd, körfält 6, 7, 8) märkta med en GreenLys in vitro-märkningssats (C) och färgade med Coomassie blue (D). De svarta pilarna indikerar de förväntade banden av syntetiserade proteiner: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Den linjära mallen och OnePot protein lösning koncentrationer var 4 nM respektive 1,6 mg/mL. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Absorbansspektra vid 260 nm. Representativa resultat av absorbansspektra vid 260 nm under hydrofobisk interaktionsrening av taggfria ribosomer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Tabell 1: Ett dagligt tidsoptimerat schema för utarbetandet av alla OnePot PURE-lösningar. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 2: PURE proteinlista Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell 1: Reagenser. Tabellen innehåller en förteckning över koncentrationer, volymer och andra specifika uppgifter om de reagenser och komponenter som använts under denna studie. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell 2: Buffertar. Kalkylbladet listar de exakta buffertkompositionerna för protein, taggfri ribosom och his-tag ribosomrening, liksom koncentrationerna av de lagerlösningar som används för deras beredning. Dessutom beräknas de nödvändiga mängderna komponenter baserat på buffertvolymen. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell 3: Beräkningar av aminosyror. Kalkylbladet listar aminosyrorna och deras rekommenderade lagerlösningskoncentrationer som krävs för energilösningen. Den beräknar mängden vatten som ska tillsättas till varje aminosyra baserat på den faktiska vägda massan, och beräknar också volymen av aminosyralösningen som ska tillsättas till den slutliga aminosyrablandningen. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell 4: Lagerlösningar för energilösningen. I tabellen anges de koncentrationer och volymer av lagerlösningar som behövs för energilösningen och ytterligare detaljer, inklusive lagringsförhållanden. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell 5: Energilösning. Tabellen innehåller en förteckning över energilösningskomponenterna och deras rekommenderade koncentrationer. Dessutom beräknar den att deras erforderliga volymer ska läggas till den slutliga lösningen baserat på deras koncentrationer av stamlösningar och energilösningens volym. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell 6: PCR. Tabellen listar sekvenser och koncentrationer av primers som används för förlängning PCR och indikerar smälttemperaturer och termocykelsteg optimerade för ett DNA-polymeras med hög återgivning. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell 7: REN reaktion. Kalkylbladet visar en exempelinställning av en PURE-reaktion. Den listar de använda koncentrationerna och volymerna av komponenterna för en PURE-reaktion med hjälp av taggfria ribosomer eller his-tag ribosomer. Dessutom beräknar den volymkvoterna för protein och ribosomtiteriter. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Protokollet som presenteras här beskriver en enkel, tids- och kostnadseffektiv metod för att förbereda ett mångsidigt PURE-uttryckssystem20 baserat på standardkompositionen15. Genom att använda protokollet tillsammans med de medföljande dagliga schemana(tabell 1)kan alla komponenter beredas på 1 vecka och ge tillräckligt med avkastning för upp till femhundra 10 μL PURE-reaktioner. Eftersom de proteiner som används i detta protokoll är överuttryckta från högkopierade plasmider och har låg toxicitet för E. coli, observeras goda uttrycksnivåer för alla nödvändiga proteiner (figur 1). Detta möjliggör enkel justering av stammar, och därför också proteinkomposition i kokulturer, helt enkelt genom att ändra förhållandet mellan inokuleringsstammarna20. Förutom ribosomproteinerna visade sig koncentrationen av EF-Tu vara av grundläggande betydelse för uttrycksutbytet6. Däremot hade förändringar i koncentrationen av de andra proteinkomponenterna en relativt låg inverkan på robustheten hos PURE-systemet7,24. Genom att justera inokuleringsförhållandet för EF-Tu med avseende på alla andra komponenter kan därför en jämförbar sammansättning med standard PURE-kompositionen uppnås, och ett PURE-system med liknande avkastning20 kan uppnås. Vid beredningen av proteinlösningen är det viktigt att se till att alla stammar växer bra och överuttrycker det kodade proteinet efter induktion (figur 1).

Ribosomfunktionen är nyckeln till den totala prestandan hos PURE-systemet24. I detta protokoll demonstreras två olika metoder för att förbereda ribosomlösningen, det vill säga taggfri och his-märkt ribosomrening. Den taggfria ribosomreningen är baserad på hydrofob interaktionskromatografi följt av centrifugering med en sackaroskudde, vilket kräver tillgång till ett FPLC-reningssystem och en ultracentrifuge15. Däremot kräver metoden som använder his-märkta ribosomer18 och gravitationsflöde affinitetskromatografirening inte specialiserad utrustning och kan utföras i de flesta laboratorier. Den senare metoden medför därför fördelar som enkelhet och tillgänglighet. Vi observerade dock ett betydligt lägre syntesutbyte när vi använde his-märkta ribosomer i OnePot PURE jämfört med den taggfria varianten (figur 3). Baserat på typen av applikation kan denna lägre avkastning vara acceptabel.

Energilösningen ger de komponenter med låg molekylvikt och tRNA som krävs för att driva TX-TL-reaktioner in vitro. Detta protokoll ger ett recept på en typisk energilösning, som enkelt kan justeras baserat på användarnas behov. Tillsammans med tRNA, NTP och kreatinfosfat har överflöd och koncentration av Mg2 + joner varit avgörande för den totala prestandan hos PURE-systemet8, eftersom de är kritiska kofaktorer för transkription och översättning. I vissa fall kan titrering av joner därför kraftigt förbättra den totala PURE-prestandan. DNA-integritet är avgörande för PURE-prestanda. Således sekvens verifierar promotorn regionen, ribosom bindande plats och mål gen och se till att en adekvat DNA-koncentration (<2 nM) hjälper till att felsöka problem som kan uppstå när du ställer in en REN reaktion.

PURE-systemet är ett minimalt TX-TL-system, och specifika applikationer kan därför kräva ytterligare justeringar25. Dessa kan inkludera att innehålla olika RNA-polymeraser9,26,förkläden13och proteinfaktorer som EF-P eller ArfA8. Även om uttrycksstammarna för dessa proteiner kan inkluderas i kokulturerna, kan tillsats av dem separat till det beredda systemet ge bättre kontroll över de nödvändiga proteinnivåerna. Dessutom är införandet av blåsor avgörande för produktionen av membranproteiner10,11. Oxidera snarare än att minska miljöer och en disulfidbindning isomeras underlättar korrekt disulfidbindningsbildning, vilket till exempel krävs för sekretoriska proteiner12.

Det är viktigt att se till att eventuella ytterligare komponenter inte stör reaktionen. De viktigaste faktorerna att vara uppmärksam på när du ställer in en reaktion eller lägger till andra komponenter listas nedan. Se till att varken inkompatibla buffertar används eller att jonkoncentrationerna störs. Undvik lösningar som innehåller glycerol, höga koncentrationer av kalium, magnesium, kalciumjoner, osmolyter, pyrofosfat, antibiotika eller EDTA, så mycket som möjligt. Att till exempel ersätta en elutionsbuffert med vatten under DNA-rening kan vara fördelaktigt eftersom EDTA är en vanlig tillsats i denna buffert. Att förse lösningarna med ytterligare negativt laddade molekyler som NTP eller dNTP kräver att man justerar magnesiumkoncentrationen8, eftersom de negativt laddade molekylerna beter sig som kelaterande medel och binder positivt laddade molekyler. Ett neutralt pH-värdet är idealiskt för reaktionen. Alla komponenter bör därför buffras till motsvarande pH- Detta är särskilt viktigt för mycket sura eller grundläggande molekyler som NTPs. Slutligen är temperatur och volym viktiga parametrar för reaktionen. För att uppnå ett bra utbyte bör man införa en temperatur runt 37 °C, eftersom temperaturer under 34 °C avsevärt kommer att minska avkastningen27.

Det är relevant att notera att innan man förbereder OnePot PURE bör man överväga målapplikationen och tillhörande krav, såsom volym, renhet, enkel modifiering och införande eller utelämnande av komponenter. För många applikationer kommer systemet att vara ett utmärkt val, men andra kan kräva avkastning, justerbarhet och andra faktorer, som OnePot-systemet inte kan tillhandahålla. Oavsett kommer det införda protokollet att vara fördelaktigt för utarbetandet av alla hemgjorda system, eftersom alla kritiska steg för sådan förberedelse sammanfattas här.

En av de främsta fördelarna med OnePot-systemet är dess kompatibilitet med det kommersiellt tillgängliga PURExpress-systemet, vilket ger möjlighet att testa funktionaliteten och integriteten hos alla komponenter separat genom att sekventiellt ersätta varje PURExpress-komponent med sin OnePot-motsvarighet. Fördelarna med OnePot PURE-systemet, såsom tunability och enkel, snabb och kostnadseffektiv förberedelse, kommer att göra cellfri TX-TL tillgänglig för fler laboratorier över hela världen och bidra till att utöka implementeringen av denna kraftfulla plattform inom cellfri syntetisk biologi.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 Grant 723106, ett schweiziskt nationellt vetenskapsstiftelse (182019) och EPFL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine/SDS buffer Bio-Rad Laboratories 1610732
15 mL centrifuge tubes VWR International 525-0309
384-well Black Assay Plates Corning 3544
4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels Bio-Rad Laboratories 4561096
50 mL centrifuge tubes VWR International 525-0304
96-Well Polypropylene DeepWell plate Nunc 260252
Acetic acid, 99.8 % Acros 222140010
Äkta purifier GE Healthcare purification of tag free ribosomes
AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa Merck Millipore UFC500324
AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa Merck Millipore UFC900324
Amino acids Sigma-Aldrich LAA21-1KT
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 09718-250G
Ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin Condalab 6801
BenchMark Fluorescent Protein Standard ThermoFisher LC5928
Breathe-Easy sealing membrane Diversified Biotech Z380059-1PAK
Centrifuge tubes polycarbonate Beckman 355631 purification of tag free ribosomes
Chill-out Liquid Wax Bio-Rad Laboratories CHO1411
Creatine phosphate Sigma-Aldrich 27920
DNA Clean & Concentrator-25 (Capped) Zymo ZYM-D4034-200TS
DTT SantaCruz Biotech sc-29089B
Econo-Pac Chromatography Columns Bio-Rad Laboratories 7321010
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich 03609-250G
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes VWR International / Eppendorf 525-0133
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap Falcon 352051
Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass Scilabware 9141173
FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System Promega L5001 optional
Folinic acid Sigma-Aldrich PHR1541
Glycerol Sigma-Aldrich G7757-1L
HEPES Gibco 15630-056
HiTrap Butyl HP Column GE Healthcare 28411005 purification of tag free ribosomes
IMAC Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare 17-0921-07
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
InstantBlue Expedeon ISB1L-1L
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside) Alfa Aesar B21149.03
Laemmli buffer (2x), sample buffer Sigma-Aldrich S3401-1VL
Lysogeny broth (LB) media AppliChem A0954
Magnesium acetate Sigma-Aldrich M0631
Magnesium chloride Honeywell Fluka 63020-1L
Nickel Sulfate Alfa Aesar 15414469
NTP ThermoFisher R0481
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) ThermoFisher F530S
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405-1KG
Potassium glutamate Sigma-Aldrich 49601
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit NEB E6800S
PURExpress Δ Ribosome Kit NEB E3313S
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent Bio-Rad Laboratories 5000205
Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units ThermoFisher 564-0020
RNaseA solution Promega A7973
SealPlate film Excel Scientific Z369659-100EA
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 6203
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid) Sigma-Aldrich 646547-10X1mL
Thickwall Polycarbonate Tube Beckman 355631
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T0699
Tris base ThermoFisher BP152-500
tRNA Roche 10109541001
Ultracentrifuge Optima L-80 Beckman purification of tag free ribosomes
Whatman GD/X syringe filters GE Whatman WHA68722504
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).
  2. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  3. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  4. Gaut, N. J., Adamala, K. P. Reconstituting natural cell elements in synthetic cells. Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).
  5. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  6. Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. Improved cell-free RNA and protein synthesis system. PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).
  7. Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system. Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).
  8. Li, J., et al. Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system. Translation. 5 (1), Austin, Tex. 1327006 (2017).
  9. de Maddalena, L. L., et al. GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system. ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).
  10. Kuruma, Y., Ueda, T. The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins. Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).
  11. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  12. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), San Diego, Calif. 299-304 (2005).
  13. Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).
  14. Niwa, T., et al. Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system. Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).
  15. Shimizu, Y., Ueda, T. PURE technology. Methods in molecular biology. 607, Clifton, N.J. 11-21 (2010).
  16. Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. Directed evolution of glycopeptides using mRNA display. Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).
  17. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).
  18. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).
  19. Shepherd, T., et al. De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  20. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).
  21. Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).
  22. Gesteland, R. F. Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).
  23. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  24. Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system. Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).
  25. Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes. Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).
  26. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).
  27. Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. A partially self-regenerating synthetic cell. Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).

Tags

Bioengineering nummer 172 cellfri transkriptionsöversättning PURE OnePot ren syntetisk biologi
OnePot PURE cellfritt system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grasemann, L., Lavickova, B.,… More

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE Cell-Free System. J. Vis. Exp. (172), e62625, doi:10.3791/62625 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter