Her beskrives anvendelsen af CRISPR-interferens (CRISPRi) til specifik genhæmning i Leptospira-arter. Leptospira celler omdannes ved bøjning med plasmider udtrykke dCas9 (katalytisk “døde” Cas9) og en enkelt-guide RNA (sgRNA), der er ansvarlig for base parring til det ønskede genomiske mål. Metoder til validering af genhæmning præsenteres.
Leptospirose er en global forsømt zoonose, der er ansvarlig for mindst 1 million tilfælde om året og næsten 60 tusind dødsfald. Sygdommen er forårsaget af patogene og virulente bakterier af slægten Leptospira, enten ved direkte kontakt med bakterierne eller indirekte ved udsættelse for forurenet vand eller jord. Husdyr og vilde dyr fungerer som reservoirværter for infektion og kaster leptospirer fra koloniserede nyrerør i nyrerne via urin i miljøet. Generering af mutantstammer af Leptospira er afgørende for at evaluere og forstå patogene infektionsmekanismer. CRISPR interferens (CRISPRi) har vist sig at være et ligetil, overkommeligt og specifikt værktøj til genhæmning i patogen Leptospira. Derfor vil de metodologiske detaljer for opnåelse af plasmidkonstruktioner, der indeholder både dCas9 og guide RNA, levering af plasmider til Leptospira ved bøjning med E. coli-stammen β2163 og transkonjugant genopretning og evaluering, blive beskrevet. Derudover giver de nyligt beskrevne Hornsby-Alt-Nally (HAN) medier mulighed for relativt hurtig isolation og udvælgelse af mutantkolonier på agarplader.
Leptospirose er en forsømt verdensomspændende zoonose forårsaget af patogene og virulente arter af slægten Leptospira. Hos mennesker tegner sygdommen sig for mere end en million tilfælde og 60.000 dødsfald om året på verdensplan1,2. Indtil videre er der ingen langsigtet og effektiv vaccine mod sygdommen. Identifikationen af virulensfaktorer og patogene mekanismer er afgørende for udviklingen af bedre terapeutiske og profylaktiske strategier. Derfor er evnen til at generere genetiske mutationer og vurdere den resulterende fænotype afgørende for funktionel genomisk analyse3.
Opførelsen af mutanter i patogen Leptospira blev indtil nu betragtet som i sagens natur ineffektiv, besværlig, dyr og vanskelig at gennemføre. Dette scenarie ændrede sig drastisk med anvendelsen af crispr-interferensen (CRISPRi) for nylig på saprofytiske4 og patogene5 leptospirer.
Genhæmning opnås ved at udtrykke to komponenter: en variant af CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated) enzyme Cas9 fra Streptococcus pyogenes, kaldet katalytisk døde Cas9 (dCas9) og en single-guide RNA (sgRNA), der kan redigeres i henhold til det ønskede mål6,7,8. dCas9-protein, når det er bundet til sgRNA, dirigeres til specifikke DNA-mål af Watson og Crick-baseparring, hvilket forårsager en sterisk blokering til RNA polymeraseforlængelse, hvilket resulterer i genhæmning på grund af den blokerede gentransskription7 (Figur 1).
Dette manuskript har til formål at beskrive opførelsen af plasmid for at udtrykke både dCas9 og sgRNA, bøjning mellem donor E. coli β2163 og modtager Leptospira celler, transkonjugant opsving, og endelig validering af udvalgte mutant kolonier.
Efter den tidlige sekventering af patogene15,16,17,18 og saprofytiske19 Leptospira arter, data mining af genomet kaste lys over flere aspekter af leptospiral patogenese. I de fleste tilfælde blev proteinfunktionen udforsket ved hjælp af den rekombinante modstykke til formodede leptospirale overfladeeksponerede proteiner og efterfølgende spekulation i den oprindelige proteinfunktion20,21,22,23,24,25,26.
Generering af mutanter og evaluering af deres respektive fænotype er nøglekomponenter i funktionel genomanalyse. De første forsøg på at generere mutanter i Leptospira spp. blev opnået ved tilfældig transposon mutagenesis27,28,29,30; men efter omfattende og besværlig analyse for at udlede identiteten af forstyrrede gener blev det bemærket, at kun 15% af alle gener i L. interrogans serovar Manilae blev forstyrret27. Målrettet gen knockout blev yderligere opnået ved homolog rekombination udnytte selvmord plasmider til at levere en antibiotikaresistens kassette flankeret af homologe arme inden for det ønskede mål31,32.
Ved at anvende disse teknologier blev flere aspekter af leptospiral grundlæggende biologi og virulens udforsket31,33,34,35,36,37. Udviklingen af E. coli–Leptospira konjugativ shuttle vektor, pMaOri 11, tillod levering af komponenter til episomal genhæmning.
Det blev tidligere påvist, at Cas9-induceret dobbeltstrengsbrud er dødelig for Leptospira spp., og som et alternativ kan den katalytisk inaktive variant af enzymet dCas9 bruges til at opnå genhæmning hos både saprofytiske og patogene arter4,5. Ved at bruge plasmid pMaOri.dCas9 som rygrad for sgRNA kassette ligation, specifikke og stabile genhæmning kan opnås på grund af udtryk for både dCas9 og sgRNA; dCas9-bundet sgRNA vil føre proteinet til det ønskede mål ved Watson-Crick base parring.
For fuldstændig genhæmning skal protospaceren designes på basis af skabelonstrengen i det ønskede gen, så baseparring af sgRNA sker med kodningsstrengen. Baseret på et gennemsnitligt C +G-indhold på 35% i Leptospira spp., vil PAM 5′-NGG-3′ forekomme mindst 3 gange hver 100 bp. Derfor vil stort set ethvert gen inden for Leptospiras genom indeholde mindst én PAM. Men hvis motivet NGG ikke findes, kan det alternative NAG-motiv evalueres.
Tidligere genhæmningsteknikker, såsom zinkfingre og TALE (transskriptionsaktivatorlignende effektorer), stolede på opførelsen af et andet protein til hvert mål, hvilket gjorde disse teknikker besværlige og dyre38. I CRISPRi’s tilfælde er den variable komponent sgRNA, hvilket gør det nødvendigt kun at ændre de 20 bp ved 5’s ende. Komplet, stabil, og målrettet genhæmning er blevet observeret ikke kun i Leptospira spp.4,5, men også i andre bakterier8,39,40,41.
Udviklingen af HAN medier13 begunstiget inddrivelse af mutanter ved drastisk at reducere inkubation tid til koloni dannelse og giver Leptospira til at vokse på 37 oC. Under bøjningstrinnet anbefales det imidlertid ikke at anvende det, da E. coli kraftigt kan formere sig i dette medie og overvinde den tilsigtede 1:1-andel mellem donor- og recipientceller. På nuværende tidspunkt er EMJH plus DAP det bedste valg, da E. coli replikerer dårligt i disse medier. Det er værd at nævne, at nogle laboratorier gør in-house suppleret EMJH, som kan indeholde yderligere komponenter, der også kan understøtte væksten af E. coli celler.
Bøjningsprotokollen, der blev præsenteret her, blev optimeret til L. interrogans serovar Copenhageni stamme Fiocruz L1-130, og det blev også vist sig at være effektivt i omdannelsen af en nyligt isoleret patogen stamme fra jordprøver5. Indledende forsøg med forskellige serovars af L. borgpetersenii arter indikerer lavere bøjningseffektivitet med den beskrevne protokol. Når der arbejdes med forskellige arter/serovarer af Leptospira, bør optimale betingelser for bøjning således bestemmes empirisk under hensyntagen til donor-/modtagercelleproportioner, indledende celletætheder, bøjningsmedier og tid (24 og 48 timer). Det er rimeligt at antage, at forskellige Leptospira arter og serovars vil opføre sig anderledes med forskellige bøjning protokoller.
Selvom saprofytiske Leptospira kolonier er relativt nemme at visualisere på plader, kan patogene kolonier være vanskeligere at observere. Normalt, ved hjælp af HAN medier suppleret med 0,4% kanin serum og spectinomycin, transkonjugant kolonier kan observeres på dag 10. Det er vores erfaring, kolonier oprindeligt til stede som en gennemsigtig glorie på medieoverfladen. I videoprotokollen vises tættere kolonier efter 14 dages vækst, da de gennemsigtige var vanskelige at filme. På dette stadium kan rotation af pladen for at opnå forskellig lysforekomst og skift mellem hvide og mørke baggrunde hjælpe med at identificere kolonier.
For mutant validering, immunoblotting tilbyder en enkel tilgang; Da antistoffer imidlertid ikke altid er tilgængelige mod målproteiner, kan der forfølges alternative strategier til validering af genhæmning. Kvantitativ reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR) ved hjælp af primere til målgenet og en konstituerende kontrol er effektiv til at validere genhæmning, da sgRNA-guidede dCas9 er ansvarlig for blokering af gentransskription. Hvis målgenet koder et klart defineret proteinbånd i proteingeler, kan SDS-PAGE demonstrere lyddæmpning, og i henhold til lipL32-genhæmningen5. Hvis LPS biosyntesegener bringes til tavshed, kan LPS-farvning anvendes; i tilfælde af lyddæmpning af gener, der kodning for enzymer med veldefinerede substrater, er kinetiske assays med kromogene substrater gyldige strategier β-galactosidase silencing i L. biflexa blev valideret ved brug af X-gal og ONPG (ortho-Nitrophenyl-β-galactoside) substrater4.
Efter bekræftelse af genhæmning kan eksperimenter udformes med henblik på yderligere at evaluere fænotype. Bindende assays kan udføres i tilfælde af lyddæmpning af bakterielle klæbemidler; serum-udfordringsanalyser bekræftede LigA’s og LigB’s rolle i serumoverlevelse, der vises af patogene Leptospira5. Mutanter kan også bruges til at vaccinere dyr for at vurdere afdæmpning af virulens; i dette tilfælde bør dyr, der er podet med mutanten, kun sammenlignes med dyr, der er inficeret med celler, der indeholder pMaOri.dCas9.
Afslutningsvis beskriver den nuværende protokol anvendelsen af CRISPRi til genhæmning hos patogene Leptospira-arter ved hjælp af HAN-medier for at lette mutantgenvinding inden for 10 dage. Genhæmning kombineret med funktionel genomisk analyse vil forbedre vores forståelse af patogene mekanismer i Leptospira, og i sidste ende føre til udvikling af bedre profylaktiske strategier for sygdomsbekæmpelse.
The authors have nothing to disclose.
USDA er en lige muligheder udbyder og arbejdsgiver. Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende med det formål at give specifikke oplysninger, og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af det amerikanske landbrugsministerium. Det brasilianske agentur FAPESP (tilskud 2014/50981-0) støttede dette arbejde økonomisk; LGVF er finansieret med et stipendium fra FAPESP (2017/06731-8 og 2019/20302-8). Finansieringskilderne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelser, dataindsamling og -analyse, beslutningen om at offentliggøre eller manuskriptforberedelse. Forfatterne takker også Hannah Hill og Alexander Grimes fra USDA Visual Services for at filme og redigere videoprotokollen.
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |