Här beskrivs tillämpningen av CRISPR-interferens (CRISPRi) för specifik gensilencing i Leptospira arter. Leptospiraceller omvandlas genom konjugation med plasmider som uttrycker dCas9 (katalytiskt “döda” Cas9) och en enguide RNA (sgRNA), ansvarig för basparning till önskat genomiskt mål. Metoder för att validera gensilencing presenteras.
Leptospiros är en global försummad zoonos, ansvarig för minst 1 miljon fall per år och nästan 60 tusen dödsfall. Sjukdomen orsakas av patogena och virulenta bakterier av släktet Leptospira, antingen genom direkt kontakt med bakterierna eller indirekt av exponering för förorenat vatten eller jord. Inhemska och vilda djur fungerar som reservoarvärdar för infektion, som fäller leptospirer från koloniserade njurslanguler i njuren, via urin, i miljön. Genereringen av mutanta stammar av Leptospira är avgörande för att utvärdera och förstå patogena mekanismer för infektion. CRISPR-interferens (CRISPRi) har visat sig vara ett enkelt, prisvärt och specifikt verktyg för gensilencing i patogen Leptospira. Därför kommer de metodologiska detaljerna för att erhålla plasmidkonstruktionerna som innehåller både dCas9 och guide RNA, leverans av plasmider till Leptospira genom konjugation med E. coli-stammen β2163 och transkonjugant återhämtning och utvärdering att beskrivas. Dessutom tillåter de nyligen beskrivna Hornsby-Alt-Nally (HAN) media relativt snabb isolering och urval av mutanta kolonier på agarplattor.
Leptospiros är en försummad världsomspännande zoonos orsakad av patogena och virulenta arter av släktet Leptospira. Hos människor står sjukdomen för mer än en miljon fall och 60 000 dödsfall per år över hela världen1,2. Än så länge finns det inget långsiktigt och effektivt vaccin mot sjukdomen. Identifiering av virulens faktorer och patogena mekanismer är avgörande för utvecklingen av bättre terapeutiska och profylaktiska strategier. Därför är förmågan att generera genetiska mutationer och bedöma den resulterande fenotypen avgörande för funktionell genomisk analys3.
Konstruktionen av mutanter i patogena Leptospira ansågs hittills vara ineffektivt, mödosamt, kostsamt och svårt att genomföra. Detta scenario ändrades drastiskt med tillämpningen av den senaste CRISPR interferens (CRISPRi) till saprofytiska4 ochpatogena 5 leptospires.
Gensilencing uppnås genom uttryck av två komponenter: en variant av CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR somsociated) enzym Cas9 från Streptococcus pyogenes, kallad katalytiskt död Cas9 (dCas9) och en enda guide RNA (sgRNA), som kan redigeras enligt önskat mål6,7,8. dCas9-proteinet, när det är bundet till sgRNA, riktas till specifika DNA-mål av Watson och Crick basparning, vilket orsakar en sterisk blockering till RNA-polymerasförlängning, vilket resulterar i gensilencing på grund av den blockerade genutskriften7 (Figur 1).
Detta manuskript syftar till att beskriva konstruktionen av plasmid för att uttrycka både dCas9 och sgRNA, konjugation mellan givaren E. coli β2163 och mottagaren Leptospira celler, transconjugant återhämtning och slutligen validering av utvalda mutant kolonier.
Efter tidig sekvensering avpatogena 15,16,17,18 och saprofytiska19Leptospira arter, data mining av genomet kasta ljus på flera aspekter av leptospiral patogenes. I de flesta fall undersöktes proteinfunktionen genom att använda den rekombinanta motsvarigheten till förmodade leptospirala ytexponerade proteiner och efterföljande spekulation av den inhemska proteinfunktionen20,21,22,23,24,25,26.
Generering av mutanter, och utvärdering av deras respektive fenotyp, är viktiga komponenter i funktionell genomisk analys. Initiala försök att generera mutanter i Leptospira spp. uppnåddes av slumpmässig transposon mutagenesis27,28,29,30; Men efter omfattande och mödosam analys för att härleda identiteten på störda gener noterades det att endast 15% av alla gener i L. interrogans serovar Manilae stördes27. Riktad gen knockout uppnåddes ytterligare genom homolog rekombination med hjälp av självmord plasmider för att leverera en antibiotikaresistens kassett flankerad av homologa armar inom det önskade målet31,32.
Genom att tillämpa dessa tekniker utforskades flera aspekter av leptospiral grundläggande biologi och virulens31,33,34,35,36,37. Utvecklingen av E. coli–Leptospira konjugativ skyttel vektor, pMaOri 11, tillät leverans av komponenter för episomal gen tystning.
Det visades tidigare att den Cas9-inducerade dubbelsträngsbrytningen är dödlig för Leptospira spp. och som ett alternativ kan den katalytiskt inaktiva varianten av enzymet, dCas9, användas för att uppnå gensilencing i både saprofytiska och patogena arter4,5. Genom att använda plasmid pMaOri.dCas9 som ryggrad för sgRNA kassett ligatur, specifika och stabila gen ljuddämpning kan erhållas på grund av uttryck av både dCas9 och sgRNA; dCas9-bundna sgRNA kommer att leda proteinet till önskat mål genom Watson-Crick basparning.
För fullständig gensilencing bör protospacern utformas baserat på mallsträngen i den önskade genen så att basparning av sgRNA sker med kodningssträngen. Baserat på ett genomsnittligt C+G-innehåll på 35% i Leptospira spp., kommer PAM 5 ‘-NGG-3’ att inträffa minst 3 gånger var 100:e bp. Därför kommer praktiskt taget alla gener inom genomet av Leptospira att innehålla minst en PAM. Om motivet NGG inte hittas kan dock det alternativa NAG-motivet utvärderas.
Tidigare gensilencing tekniker, såsom zink fingrar och TALE (transkription activator-liknande effectors), förlitade sig på konstruktionen av ett annat protein till varje mål, vilket gör dessa tekniker mödosamma ochkostsamma 38. När det gäller CRISPRi är den variabla komponenten sgRNA, vilket gör det nödvändigt att endast ändra 20 bp vid 5′ änden. Fullständig, stabil och riktad gensilencing har observerats inte bara i Leptospira spp.4,5, men också i andra bakterier8,39,40,41.
Utvecklingen av HAN media13 gynnade återhämtningen av mutanter genom att drastiskt minska inkubationstiden för kolonibildning och låta Leptospira växa vid 37 oC. Under konjugationssteget rekommenderas dock inte dess användning eftersom E. coli kraftigt kan spridas i detta medium och övervinna den avsedda 1:1-andelen mellan donator- och mottagarceller. I detta skede är EMJH plus DAP det bättre valet, eftersom E. coli replikerar dåligt i detta media. Det är värt att nämna att vissa laboratorier gör internt kompletterad EMJH, som kan innehålla ytterligare komponenter som också kan stödja tillväxten av E. coli-celler.
Konjugationsprotokollet som presenteras här optimerades för L. interrogans serovar Copenhageni stam Fiocruz L1-130, och det visade sig också vara effektivt vid omvandlingen av en nyligen isolerad patogen stam från jordprover5. Inledande försök med olika serovars av L. borgpetersenii arter indikerar lägre konjugation effektivitet med det beskrivna protokollet. När man arbetar med olika arter/serovaner av Leptospirabör optimala förutsättningar för konjugation fastställas empiriskt, med beaktande av givaren: mottagarcellsproportioner, initiala celltätheter, konjugationsmedier och tid (24 och 48 h). Det är rimligt att anta att olika Leptospira arter och serovars kommer att bete sig annorlunda med olika konjugation protokoll.
Även om saprofytiska Leptospira kolonier är relativt lätta att visualisera på plattor, kan patogena kolonier vara svårare att observera. Normalt, genom att använda HAN-media kompletterat med 0,4% kaninserum och spectinomycin, kan transkonjugantkolonier observeras dag 10. Enligt vår erfarenhet presenterar kolonier inledningsvis som en transparent halo vid medieytan. I videoprotokollet visas tätare kolonier, efter 14 dagars tillväxt, eftersom de transparenta var svåra att filma. I detta skede kan rotera plattan för att uppnå olika ljusförekomst och skifta mellan vita och mörka bakgrunder hjälpa till att identifiera kolonier.
För mutant validering erbjuder immunoblotting ett enkelt tillvägagångssätt; Men eftersom antikroppar inte alltid är tillgängliga mot målproteiner kan alternativa strategier för att validera gensilencing eftersträvas. Kvantitativ omvänd-transkriptase PCR (qRT-PCR) med primers för mål genen och en konstituerande kontroll är effektiv för att validera gen ljuddämpande eftersom sgRNA-guidad dCas9 ansvarar för blockering av gen transkription. Om målgenen kodar ett tydligt definierat proteinband i proteingeler kan SDS-PAGE demonstrera ljuddämpande och enligt lipL32-genen som tystar5. Om LPS biosyntesgener tystas kan LPS-färgning användas. När det gäller att tysta gener som kodar för enzymer med väldefinierade substrat är kinetiska analyser med kromogena substrat giltiga strategier. β-galactosidase-tystande i L. biflexa validerades genom användning av X-gal och ONPG (orto-Nitrophenyl-β-galactoside) substrat4.
Efter bekräftelse av gensilencing, experiment kan utformas för att ytterligare utvärdera fenotyp. Bindande analyser kan utföras vid tystning av bakteriella vidhäftningar; serum-utmaning analyser bekräftade rollen av LigA och LigB i serum överlevnad visas av patogena Leptospira5. Mutanter kan också användas för att inokulera djur för att bedöma dämpning av virulens; I detta fall bör djur som vaccineras med mutanten jämföras med de djur som är infekterade med celler som endast innehåller pMaOri.dCas9.
Sammanfattningsvis beskriver det nuvarande protokollet tillämpningen av CRISPRi för gensilencing hos patogena Leptospira arter med han media för att underlätta mutant återhämtning inom 10 dagar. Gensilencing i kombination med funktionell genomisk analys kommer att förbättra vår förståelse av patogena mekanismer i Leptospira, och i slutändan leda till utvecklingen av bättre profylaktiska strategier för sjukdomsbekämpning.
The authors have nothing to disclose.
USDA är en leverantör av lika möjligheter och arbetsgivare. Omnämnande av handelsnamn eller kommersiella produkter i denna publikation är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller godkännande från U.S. Department of Agriculture. Det brasilianska organet FAPESP (grant 2014/50981-0) stödde detta arbete ekonomiskt. LGVF finansieras med ett stipendium från FAPESP (2017/06731-8 och 2019/20302-8). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller manuskriptförberedelse. Författarna tackar också Hannah Hill och Alexander Grimes från USDA Visual Services för att de filmat och redigerat videoprotokollet.
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |