Qui viene descritta l’applicazione dell’interferenza CRISPR (CRISPRi) per un silenziamento genico specifico nelle specie di Leptospira. Le cellule leptospira sono trasformate coniugando con plasmidi che esprimono dCas9 (cas9 cataliticamente “morto”) e un RNA a guida singola (sgRNA), responsabile dell’accoppiamento di base al bersaglio genomico desiderato. Vengono presentati metodi per convalidare il silenziamento genico.
La leptospirosi è una zoonosi trascurata a livello globale, responsabile di almeno 1 milione di casi all’anno e quasi 60 mila decessi. La malattia è causata da batteri patogeni e virulenti del genere Leptospira, sia per contatto diretto con i batteri che indirettamente per esposizione ad acqua o suolo contaminati. Gli animali domestici e selvatici agiscono come ospiti serbatoi di infezione, versando leptospire da tubuli renali colonizzati del rene, attraverso l’urina, nell’ambiente. La generazione di ceppi mutanti di Leptospira è fondamentale per valutare e comprendere i meccanismi patogeni dell’infezione. L’interferenza CRISPR (CRISPRi) si è dimostrata uno strumento semplice, conveniente e specifico per il silenziamento genico nel Leptospira patogeno. Pertanto, verranno descritti i dettagli metodologici per ottenere i costrutti plasmidi contenenti sia dCas9 che RNA guida, la consegna di plasmidi a Leptospira coniugazione con il ceppo E. coli β2163 e il recupero e la valutazione transcongiunti. Inoltre, i supporti Hornsby-Alt-Nally (HAN) recentemente descritti consentono l’isolamento relativamente rapido e la selezione delle colonie mutanti sulle placche di agar.
La leptospirosi è una zoonosi trascurata in tutto il mondo causata da specie patogene e virulenti del genere Leptospira. Nell’uomo, la malattia rappresenta più di un milione di casi e 60.000 decessi all’anno intutto il mondo 1,2. Finora non esiste un vaccino efficace e a lungo termine per la malattia. L’identificazione dei fattori di virulenza e dei meccanismi patogeni è fondamentale per lo sviluppo di migliori strategie terapeutiche e profilattiche. Pertanto, la capacità di generare mutazioni genetiche e valutare il fenotipo risultante è fondamentale per l’analisi genomica funzionale3.
La costruzione di mutanti in Leptospira patogeno era considerata, fino ad ora, intrinsecamente inefficiente, laboriosa, costosa e difficile da implementare. Questo scenario è cambiato drasticamente con l’applicazione della recente interferenza CRISPR (CRISPRi) alle leptospire saprofite4 e patogene 5.
Il silenziamento genico si ottiene con l’espressione di due componenti: una variante dell’enzima CRISPR/Cas(clustro regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated) Cas9 da Streptococcus pyogenes, chiamato Catalytically dead Cas9 (dCas9) e un RNA a guida singola (sgRNA), che può essere modificato in base al target desiderato6,7,8. La proteina dCas9, quando legata allo sgRNA, è diretta a specifici bersagli di DNA dall’accoppiamento di base di Watson e Crick, causando un blocco sterico all’allungamento dell’RNA polimerasi, con conseguente silenziamento genico a causa della trascrizione genicaostruita 7 (Figura 1).
Questo manoscritto ha lo scopo di descrivere la costruzione del plasmide per esprimere sia dCas9 che sgRNA, coniugazione tra il donatore E. coli β2163 e le cellule leptospira riceventi, recupero transcongiuntino e, infine, convalida di colonie mutanti selezionate.
Dopo il sequenziamento precoce delle specie patogene15,16,17,18 e saprophytic19Leptospira, l’estrazione dei dati del genoma ha fatto luce su diversi aspetti della patogenesi leptospirale. Nella maggior parte dei casi, la funzione proteica è stata esplorata utilizzando la controparte ricombinante di proteine putative leptospirali esposte in superficie e la successiva speculazione della funzione proteica nativa20,21,22,23,24,25,26.
La generazione di mutanti, e la valutazione del loro rispettivo fenotipo, sono componenti chiave dell’analisi genomica funzionale. I primi tentativi di generare mutantiin Leptospira spp. tuttavia, dopo un’analisi approfondita e laboriosa per aver dedotto l’identità dei geni interrotti, è stato notato che solo il 15% di tutti i geni in L. interrogans serovar Manilae sono statiinterrotti 27. Il knockout genico mirato è stato ulteriormente raggiunto mediante ricombinazione omologa utilizzando plasmidi suicidi per fornire una cassetta di resistenza agli antibiotici affiancata da bracci omologhi all’interno del bersagliodesiderato 31,32.
Applicando queste tecnologie, sono stati esplorati diversi aspetti della biologia di base leptospirale e della virulenza31,33,34,35,36,37. Lo sviluppo del vettore navetta coniugale E. coli–Leptospira, pMaOri 11, ha permesso la consegna di componenti per silenziamento genico episomale.
È stato precedentemente dimostrato che la rottura a doppio filamento indotta da Cas9 è letale per Leptospira spp. Utilizzando il plasmide pMaOri.dCas9 come spina dorsale per la legatura a cassetta sgRNA, è possibile ottenere silenziamento genico specifico e stabile grazie all’espressione sia di dCas9 che di sgRNA; Lo sgRNA legato a dCas9 porterà la proteina al bersaglio desiderato dall’accoppiamento di base Watson-Crick.
Per un silenziamento genico completo, il protospaziore deve essere progettato in base al filamento modello del gene desiderato in modo che l’accoppiamento di base dello sgRNA avvenga con il filamento codificante. Sulla base di un contenuto medio di C+G del 35% in Leptospira spp., il PAM 5′-NGG-3′ si verificherà almeno 3 volte ogni 100 bp. Pertanto, praticamente qualsiasi gene all’interno del genoma di Leptospira conterrà almeno un PAM. Tuttavia, se il motivo NGG non viene trovato, è possibile valutare il motivo NAG alternativo.
Le precedenti tecniche di silenziamento genico, come le dita di zinco e TALE (effettori attivatori di trascrizione), si basavano sulla costruzione di una proteina diversa per ogni bersaglio, rendendo queste tecniche laboriose ecostose 38. Nel caso di CRISPRi, il componente variabile è lo sgRNA, rendendo necessario modificare solo il 20 bp alla fine di 5 ‘. Il silenziamento genico completo, stabile e mirato è stato osservato non solo in Leptospira spp.4,5, ma anche in altribatteri 8,39,40,41.
Lo sviluppo dei media HAN13 favorì il recupero dei mutanti riducendo drasticamente i tempi di incubazione per la formazione della colonia e permettendo a Leptospira di crescere a 37 oC. Tuttavia, durante la fase di coniugazione, il suo uso non è raccomandato poiché E. coli può proliferare vigorosamente in questo mezzo e superare la proporzione 1:1 prevista tra le cellule donatrici e ricevente. In questa fase, EMJH più DAP è la scelta migliore, dal momento che E. coli si replica male in questo supporto. Vale la pena ricordare che alcuni laboratori protetiamo EMJH integrato internamente, che può contenere componenti aggiuntivi che potrebbero anche sostenere la crescita delle cellule E. coli.
Il protocollo di coniugazione qui presentato è stato ottimizzato per il ceppo L. interrogans serovar Copenhageni Fiocruz L1-130, ed è stato anche dimostrato essere efficace nella trasformazione di un ceppo patogeno recentemente isolato dai campioni di terreno5. I primi tentativi con diversi sierovar di specie L. borgpetersenii indicano minori efficienze coniuganti con il protocollo descritto. Pertanto, quando si lavora con diverse specie/sierovar di Leptospira, le condizioni ottimali per la coniugazione devono essere determinate empiricamente, considerando le proporzioni delle cellule donatrici:riceventi, le densità iniziali delle cellule, i mezzi di coniugazione e il tempo (24 e 48 ore). È ragionevole supporre che diverse specie di Leptospira e sierovar si comporteranno in modo diverso con diversi protocolli di coniugazione.
Anche se le colonie saprofite di Leptospira sono relativamente facili da visualizzare sulle placche, le colonie patogene possono essere più difficili da osservare. Normalmente, utilizzando mezzi HAN integrati con siero di coniglio allo 0,4% e spectinomicina, le colonie transconigiunti possono essere osservate al giorno 10. Nella nostra esperienza, le colonie inizialmente presenti come un alone trasparente sulla superficie dei media. Nel protocollo video, le colonie più dense, dopo 14 giorni di crescita, vengono mostrate poiché quelle trasparenti erano difficili da filmare. In questa fase, ruotare la piastra per ottenere una diversa incidenza della luce e spostarsi tra sfondi bianchi e scuri può aiutare a identificare le colonie.
Per la convalida mutante, l’immunoblotting offre un approccio semplice; tuttavia, poiché gli anticorpi non sono sempre disponibili contro le proteine bersaglio, è possibile perseguire strategie alternative per convalidare il silenziamento genico. La PCR quantitativa a trascrizione inversa (qRT-PCR) che utilizza primer per il gene bersaglio e un controllo costitutivo è efficace per convalidare il silenziamento genico poiché dCas9 guidato dallo sgRNA è responsabile del blocco della trascrizione genica. Se il gene bersaglio codifica una banda proteica chiaramente definita nei gel proteici, SDS-PAGE può dimostrare silenziamento e, secondo il gene lipL32 silenziamento5. Se i geni della biosintesi LPS vengono silenziati, è possibile utilizzare la colorazione LPS; nel caso della codifica dei geni silenzianti per enzimi con substrati ben definiti, i test cinetici con substrati cromogenici sono strategie valide; β silenziamento della β-galattosidasi in L. biflexa è stato convalidato dall’uso di substrati X-gal e ONPG (orto-Nitrofenil-β-galattoside)4.
Dopo la conferma del silenziamento genico, gli esperimenti possono essere progettati per valutare ulteriormente il fenotipo. I test di legame possono essere eseguiti in caso di silenziamento di adesine batteriche; i saggi siero-sfida hanno confermato il ruolo di LigA e LigB nella sopravvivenza del siero mostrato dalla patogena Leptospira5. I mutanti possono anche essere usati per inoculare gli animali per valutare l’attenuazione della virulenza; in questo caso, gli animali inoculati con il mutante devono essere confrontati con quelli infetti da cellule contenenti solo pMaOri.dCas9.
In conclusione, l’attuale protocollo descrive l’applicazione di CRISPRi per il silenziamento genico nelle specie patogene di Leptospira utilizzando i media HAN per facilitare il recupero mutante entro 10 giorni. Il silenziamento genico combinato con l’analisi genomica funzionale migliorerà la nostra comprensione dei meccanismi patogeni di Leptospirae, in ultima analisi, porterà allo sviluppo di migliori strategie profilattiche per il controllo delle malattie.
The authors have nothing to disclose.
L’USDA è un fornitore e un datore di lavoro per le pari opportunità. La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha lo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica una raccomandazione o un’approvazione da parte del Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti. L’agenzia brasiliana FAPESP (sovvenzione 2014/50981-0) ha sostenuto finanziariamente questo lavoro; LGVF è finanziato con una borsa di studio della FAPESP (2017/06731-8 e 2019/20302-8). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione, raccolta e analisi dei dati, decisione di pubblicare o preparazione di manoscritti. Gli autori ringraziano anche Hannah Hill e Alexander Grimes dell’USDA Visual Services per aver filmato e modificato il protocollo video.
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |