Implantation av ett kranialfönster för upprepad in vivo-avbildning hos vakna möss
Summary
Här presenteras ett protokoll för implantation av ett kroniskt kranialfönster för längsgående avbildning av hjärnceller hos vakna, huvudhållna möss.
Abstract
För att fullt ut förstå den cellulära fysiologin hos neuroner och glia hos uppträdande djur är det nödvändigt att visualisera deras morfologi och registrera deras aktivitet in vivo hos möss som beter sig. Detta dokument beskriver en metod för implantation av ett kroniskt kranialfönster för att möjliggöra längsgående avbildning av hjärnceller i vakna, huvudhållna möss. I kombination med genetiska strategier och virala injektioner är det möjligt att märka specifika celler och regioner av intresse med strukturella eller fysiologiska markörer. Detta protokoll visar hur man kombinerar virala injektioner för att märka neuroner i närheten av GCaMP6-uttryckande astrocyter i cortex för samtidig avbildning av båda cellerna genom ett kranialfönster. Multifotonavbildning av samma celler kan utföras i dagar, veckor eller månader i vakna, uppträdande djur. Detta tillvägagångssätt ger forskare en metod för att se cellulär dynamik i realtid och kan tillämpas för att svara på ett antal frågor inom neurovetenskap.
Introduction
Förmågan att utföra in vivo multifotonfluorescensmikroskopi i mössens cortex är av största vikt för studien av cellulär signalering och struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, sjukdomspatologi 10,11 och cellulär utveckling12,13 . Med implantation av kroniska kranialfönster är längsgående avbildning möjlig, vilket möjliggör upprepad avbildning av kortikala områden i dagar, veckor eller månader13,14 hos levande djur. Multifotonmikroskopi är idealisk för in vivo, upprepad avbildning på grund av förbättrad djupprobning och minskad fotoskada i samband med den infraröda lasern som används. Detta möjliggör studier av molekylär och cellulär dynamik hos specifika celler i olika kortikala regioner.
Multifotonmikroskopi har använts för in vivo-avbildning av neuronala och gliaceller hos möss 15,16,17,18,19,20. Olika strategier kan implementeras för att märka särskilda celltyper och intresseområden. Ett vanligt tillvägagångssätt är att driva uttrycket av genetiskt kodade fluorescerande proteiner på ett cellspecifikt sätt med hjälp av Cre-Lox-rekombinationssystemet. Detta kan utföras med genetiskt modifierade möss, t.ex. genom att korsa tdTomato “floxed” mus (Ai14) med en mus som uttrycker Cre-recombinase under en promotor av intresse21. Alternativt kan cell- och platsspecifik märkning uppnås med virala injektioner. Här injiceras ett virus som kodar för Cre-rekombinas under en cellspecifik promotor och ett virus som kodar för en floxed gen av intresse i en definierad region. Lämpliga celltyper som tar emot båda virusvektorerna kommer då att uttrycka den eller de önskade generna. Dessa gener kan vara strukturella markörer, såsom tdTomato, för att se förändringar i cellulär morfologi22 eller genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI), såsom GCaMP och / eller RCaMP, för att undersökakalciumdynamiken 23. Metoder för genetisk rekombination kan tillämpas individuellt eller i kombination för att märka en eller flera celltyper. Ett tredje tillvägagångssätt, som inte kräver transgena möss eller virala konstruktioner (som har begränsad förpackningskapacitet), är in utero elektroporering av DNA-konstruktioner24. Beroende på tidpunkten för elektroporationen kan olika celltyper riktas 25,26,27.
När du utför multifotonavbildning kan möss avbildas medan de är vakna eller bedövade. Avbildning av vakna möss kan utföras genom att fästa musen via en fäst huvudplatta28. Detta tillvägagångssätt görs mindre stressande genom att tillåta relativt fri rörlighet för djuret med hjälp av metoder, såsom fritt flytande, luftstödda styrofoambollar29, fritt flytande löpband1 eller ett luftlyft hembursystem där möss fästs av en fäst huvudplatta och får röra sig i en öppen kammare30. För vart och ett av dessa avbildningsförhållanden kommer det först att vara nödvändigt att vanora mössen till bildinställningen. Detta dokument beskriver tillvänjnings- och bildbehandlingsproceduren med hjälp av ett luftlyft hembursystem.
Detta protokoll beskriver implantationen av ett kroniskt kranialfönster för längsgående in vivo-avbildning i cortex. Här kommer vi att använda möss som villkorligt uttrycker GCaMP6f i astrocyter för att övervaka kalciumsignaldynamiken. Vidare beskriver detta dokument proceduren för virala injektioner med tdTomato som en etikett för neuroner. Detta möjliggör bestämning av förändringar i neuronal synaptisk struktur och / eller tillgängligheten som en strukturell markör som möjliggör upprepad avbildning av samma astrocyt. Under hela protokollet kommer viktiga steg att belysas för att säkerställa bästa möjliga kvalitet på bilder som erhållits från multifotonmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi presenterat ett protokoll för implantation av kroniska kranialfönster för in vivo-avbildning av kortikala astrocyter och neuroner i vakna, huvudhållna möss på en luftlyft hembur. Specifika exempel har tillhandahållits på kranialfönsterapplikationen för avbildning av astrocyter som uttrycker GECI och neuronala synaptiska strukturer. Med hjälp av multifotonmikroskopi kan astrocytisk kalciumsignaldynamik och strukturell synaptisk dynamik registreras upprepade gånger under dagar.
<p class…Materials
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium–implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer’s disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
