ניתוח מחזור התא עם תיוג 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ו פוספו-histone H3 (pH3) הוא הליך רב-שלבי שעשוי לדרוש אופטימיזציה נרחבת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים עבור הליך זה כולל ניתוח תמונה וכימות כדי להבחין בין תאים בשלבי מחזור תאים שונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
5-אתניל-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila
במאמר זה
סיכום
תקציר
In vivo ניתוח התקדמות מחזור התא מבוצע באופן שגרתי במחקרים על גנים המסדירים מיטוזה ושכפול DNA. 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) נוצל כדי לחקור התקדמות שכפול/ S-פאזה, בעוד נוגדנים נגד פוספו-histone H3 נוצלו כדי לסמן גרעינים מיוטיים ותאים. שילוב של שתי התוויות יאפשר סיווג של של שלב G0/G1 (שלב פער), S (שכפול) ו- M (מיטוטי) וישמש ככלי חשוב להערכת ההשפעות של נוקאאוטים גנטיים מיוטיים או מוטציות ריקות על התקדמות מחזור התא. עם זאת, ריאגנטים המשמשים לסימון תאים המסומנים על-ידי EdU אינם תואמים למספר תגי נוגדנים-פלואורסצנטיים משניים. זה מסבך חיסונים, שבו נוגדנים משניים ראשוניים ומתויגים משמשים לסימון תאי מיטוט חיוביים pH3. מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב לתיוג כפול של EdU ו- pH3 בתאי גזע עצביים זחל Drosophila, מערכת בשימוש נרחב כדי לחקור גורמים מיוטיים. בנוסף, פרוטוקול מסופק לניתוח וכימות תמונה כדי להקצות תאים מסומנים ב-3 קטגוריות נפרדות, של שלבים G0/G1, S, S>G2/M (התקדמות מ- S ל- G2/M) ושלבי M.
מבוא
מחזור חלוקת התאים כולל שלב G1 (שלב הפער הראשון), שלב שכפול/S, G2 (שלב פער שני) ושלב M (מיטוטי). עובר בשלבים אלה, התא עובר שינויים דרמטיים תמלול הסלולר, תרגום, וארגון מחדש של מכונות שלד1,2. בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים, תאים עשויים להפסיק באופן זמני להתחלק ולהיות ססגוניים (G0) או להבדיל ולהפסיק לצמיתות לחלק3. תרחישים אחרים, כגון נזק לדנ"א, עלולים לגרום לבידול מוקדם או אפופטוזיס3,4. התגובה לרמזים כאלה מתווכת על ידי מחסומי מחזור סלולריים, הפועלים כמערכת מעקב כדי להבטיח את שלמותם של תהליכים סלולריים חיוניים לפני שהתא מתחייב לש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת ריאגנטים ומלאי לבדיקת קליקים של EdU
הערה: עיין בטבלת החומרים ובטבלה 1 לקבלת פרטים אודות הערכה והריגנטים שסופקו עם הערכה.
- הביאו את הבקבוקונים לטמפרטורת החדר לפני הכנת הפתרונות.
- הכן 10 mM EdU (רכיב A) פתרון מלאי על ידי הוספת 2 מ"ל של דימתילסולפוקס (DMSO, רכיב C). מערבבים היטב ומאחסנים ב -20 מעלות צלזיוס.
- הכן פתרון עבודה של Alexa Fluor 647-azide (רכיב B) על ידי הוספת 70μL של DMSO (רכיב C). מערבבים היטב ומאחסנים ב -20 מעלות צלזיוס.
- הכן פתרון 1x של מאגר התגובה Click-iT EdU (רכיב D) על ידי ערבוב 4 מ"ל של פתרון זה עם 36 מ"ל של מים דה-יוניים. יש לאחסן את הפתרון הנותר ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המוח הזחלי השלישי של Drosophila נעשה שימוש כמערכת מודל לחקר תהליכים תאיים והתפתחותיים בסיסיים9. במוקד המחקר הנוכחי היה להציג פרוטוקול לניתוח התקדמות מחזור התא ב- EdU- ו- pH3-שכותרתו NBs של אזור CB (איור 1). ה- CB NBs מחולקים לסוג I וסוג II, והם מציגים את תבנית החלוקה האסימטרית האופיינית9. כל סוג I חטיבת NB מייצר NB, אשר מסוגל התחדשות עצמית, ועוד GMC כי הוא נגזר על בידול9. לעומת זאת, סוג II NBs ליצור מעבר-מגביר, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התאגדות EdU ותגובת ה'קליק' הבאה שלה עם אזיד חדיר לתא מציגה יתרונות מעשיים של טכניקה זו על פני שיטת BrdU בשימוש מוקדם יותר7. עם זאת, תגובה זו מזורזת על ידי יונים Cu(I), וכמה צבעים עשויים להיות לא יציבים בנוכחות זרז נחושת זה, כפי שמומלץ בבירור על ידי יצרן ערכת EdU קליק-אי. כאשר ניסויי חיסון בוצעו לאחר ביצוע שלב הזיהוי של EdU, עוצמת האות הצפויה לא נצפתה עם צבעי הערוץ האדום, אלכסה פלור 568 ו- Cy3. עם זאת, הפרוטוקול עבד כאשר תגובות חיסוניות הושלמו לפני שלב הזיהוי של EdU. עם פרוטוקול זה, ארבעה ערוצים שי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים הצהירו כי אין אינטרסים מתחרים קיימים.
תודות
עבודה זו נתמכה במימון הקרן הלאומית למדע השוויצרית (מענק פרויקט 31003A_173188; www.snf.ch) ואוניברסיטת ברן (www.unibe.ch) ל- BS. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | הכנסת אלמנט P באקסון השלישי של Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | נוצר בבית | eGFP מתויג חלבון Mms19 מבוטא ברקע Mms19p | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | מלאי מסוג פרא (w;+;+) |
| נוגדנים | ראשוניים דילול | ||
| חולדה אנטי-מירנדה | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| ארנב אנטי-pH3 | איתות תאים | 9701 | 1/200 |
| <נוגדנים משניים>חזקים | |||
| עזים נגד חולדות Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| עז נגד חולדות Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| עז נגד ארנב Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| <חזק>מגיב / ערכה< / חזק> | |||
| Aqua Poly/Mount הרכבה בינונית | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| ערכת שילוב Click-it EdU, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer | Scientific C10340 | |
| Schneider' s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| אלבומין סרום בקר (BSA) שבר V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | חומר ניקוי לא יוני |
| <חזק>תוכנה | |||
| פיג'י (Imagej)https://imagej.net/Fiji | |||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad | software גרסה 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר עם טבילה בשמן, 1.4 NA Plan-apochromat | |||
| <חזק>חומרים | |||
| אקווה פולי/הר הרכבה בינונית | מסיס במים, לא פלואורסצנטי הרכבה | ||
| בינונית פיירקס 3 או 9 שקע זכוכית ספוט נייר | |||
| סינון Whatman |
מקורות
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeut....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
