5-Etil-2'-Deoksiroridin/Fosfo-Histon H3 Drosophila Nöral Kök Hücrelerde Hücre Döngüsü İlerleme Analizi için Çift Etiketleme Protokolü

Özet

5-etil-2'-deoksiyridin (EdU) ve fosfo-histon H3 (pH3) etiketlemeli hücre döngüsü analizi, kapsamlı optimizasyon gerektirebilecek çok adımlı bir prosedürdür. Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri ayırt etmek için görüntü analizi ve niceleme dahil olmak üzere bu prosedür için tüm adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

In vivo hücre döngüsü ilerleme analizi, mitoz ve DNA replikasyonunu düzenleyen genler üzerinde yapılan çalışmalarda rutin olarak yapılmaktadır. 5-Etil-2'-deoksiyridin (EdU) replikatif/S faz ilerlemesini araştırmak için kullanılırken, fosfo-histon H3'e karşı antikorlar mitotik çekirdekleri ve hücreleri işaretlemek için kullanılmıştır. Her iki etiketin birleşimi, G0/G1 (Boşluk fazı), S (çoğaltıcı) ve M (mitotik) fazlarının sınıflandırılmasını sağlar ve mitotik gen devirmelerinin veya boş mutantların hücre döngüsü ilerlemesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için önemli bir araç olarak hizmet eder. Bununla birlikte, EdU etiketli hücreleri işaretlemek için kullanılan reaktifler birkaç ikincil antikor floresan etiketiyle uyumsuzdur. Bu, birincil ve etiketli ikincil antikorların pH3-pozitif mitotik hücreleri işaretlemek için kullanıldığı immünostainingi zorlaştırır. Bu makalede, mitotik faktörleri incelemek için yoğun olarak kullanılan bir sistem olan Drosophila larva nöral kök hücrelerinde EdU ve pH3'ün çift etiketli olarak etiketlenerek kullanılması için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, etiketli hücreleri G0/G1, S, S>G2/M (S'den G2/M'ye ilerleme) ve M aşamaları olmak üzere 3 ayrı kategoride ayırmak için görüntü analizi ve niceleme için bir protokol sağlanır.

Giriş

Hücre bölünme döngüsü bir G1 fazı (ilk boşluk fazı), bir çoğaltıcı/S fazı, bir G2 (ikinci boşluk aşaması) ve bir M (mitotik) fazını içerir. Bu aşamalardan geçen hücre, sitoskeletal makinelerin hücresel transkripsiyonunda, çevirisinde ve yeniden düzenlenmesinde dramatik değişikliklere uğrar^1,2. Gelişimsel ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak, hücreler geçici olarak bölünmeyi ve sessiz hale gelebilir (G0) veya farklılaşabilir ve kalıcı olarak³bölmeyi durdurabilir. DNA hasarı gibi diğer senaryolar erken farklılaşmaya veya apoptoz³,^4'e

Protokol

1. Click-it EdU tahlilleri için reaktiflerin ve stokların hazırlanması

NOT: Kit ve kit ile birlikte verilen reaktifler hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Masası ve Tablo 1'e bakın.

1. Çözümleri hazırlamadan önce şişeleri oda sıcaklığına getirin.
2. 2 mL dimetilsüllfoksit (DMSO, bileşen C) ekleyerek 10 mM EdU (bileşen A) stok çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın ve -20 °C'de saklayın.
3. 70μL DMSO (bileşen C) ekleyerek Alexa Fluor 647-azide (bileşen B) çalışma çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın ve -20 °C'de saklayın.
4. Bu çözeltinin 4 mL'lik kısmını 36 mL deiyonize su il....

Sonuçlar

İki loblu Drosophila üçüncü instar larva beyni, temel hücresel ve gelişimsel süreçleri incelemek için bir model sistemi olarak kullanılmıştır⁹. Mevcut çalışmanın odak noktası, CB bölgesinin EdU ve pH3 etiketli NB'lerinde hücre döngüsü ilerlemesinin analizi için bir protokol sunmaktı (Şekil 1). CB NB'leri tip I ve tip II'ye alt olarak ayrılmıştır ve karakteristik asimetrik bölme deseni⁹'u görüntülerler. Her tip I NB bölümü, kendini yeni.......

Tartışma

EdU şirketleşme ve hücre geçirgen azide ile sonraki 'tıklama' reaksiyonu, bu tekniğin daha önce kullanılan BrdU yöntemine göre pratik avantajlarını sunar⁷. Bununla birlikte, bu reaksiyon Cu(I) iyonları tarafından katalizöre edilir ve Click-it EdU kit üreticisi tarafından açıkça tavsiye edildiği gibi, bu bakır katalizörün varlığında birkaç boya kararsız olabilir. EdU algılama adımının gerçekleştirilmesinden sonra immünostaining deneyleri yapıldığı zaman, kırmızı kanal boyaları, Alexa Fluor 568 ve C.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
fly hisse senetleri
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stok merkezi	#15477	nın üçüncü ekzonuna P-elemanı ekleme
; Mms19::eGFP, Mms19p	Evde üretilen		eGFP etiketli Mms19 proteini, Mms19p arka planında ifade edilir
w1118	Bloomington stok merkezi	#3605	vahşi tip stok (w;+;+)
Birincil antikorlar			Seyreltme
Sıçan anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Tavşan anti-pH3	Hücre Sinyali	9701	1/200
< güçlü > İkincil antikorlar< / güçlü >
Keçi anti-Sıçan Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Keçi anti-Sıçan Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Keçi anti-Tavşan Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
< güçlü > Reaktif / Kit< / güçlü>
Aqua Poly/Mount montaj ortamı	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU birleştirme kiti, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider' s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Sığır serum albümini (BSA) fraksiyonu V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	iyonik olmayan deterjan
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Uygulama Paketi (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad yazılımı	Sürüm 5
Microsoft	Excel Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 lazer taramalı konfokal mikroskop, 63x yağa daldırma, 1.4 NA Plan-apokromat objektif
< güçlü > Malzemeler< / güçlü >
Aqua Poly / Montaj ortamı			suda çözünür, floresan olmayan montaj ortamı
Pyrex 3 veya 9 çöküntü cam spot plakası
Whatman filtre kağıdı

Mms19 +'