Vi beskriver här etablering och tillämpning av en Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (kallas αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedan) mus reporter linje för hjärt omprogrammering bedömning. Neonatal hjärtfibblaster (NCFs) isolerade från musstammen omvandlas till inducerade kardiomyocyter (iCMs), vilket möjliggör bekväm och effektiv utvärdering av omprogrammering effektivitet och funktionell mognad av iCMs via kalcium (Ca2 +) flöde.
Hjärt omprogrammering har blivit en potentiellt lovande terapi för att reparera ett skadat hjärta. Genom att införa flera transkriptionsfaktorer, inklusive Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kan fibroblaster omprogrammeras till inducerade kardiomyocyter (iCMs). Dessa iCMs, när de genereras in situ i ett infarcted hjärta, integreras elektriskt och mekaniskt med det omgivande hjärtmuskel, vilket leder till en minskning av ärrstorlek och en förbättring av hjärtfunktionen. På grund av den relativt låga omprogrammeringseffektiviteten, renheten och kvaliteten på iCMs är karakterisering av iCMs fortfarande en utmaning. De metoder som för närvarande används inom detta område, inklusive flödescytometri, immunocytokemi och qPCR, fokuserar främst på hjärtspecifik gen- och proteinuttryck men inte på funktionell mognad av iCMs. Utlöst av åtgärdspotentialer leder öppningen av spänningsdrivna kalciumkanaler i kardiomyocyter till en snabb tillströmning av kalcium till cellen. Därför är kvantifiering av kalciumtillströmningen en lovande metod för att utvärdera kardiomyocytfunktionen. Här introducerar protokollet en metod för att utvärdera iCM-funktion med kalcium (Ca2 +) flöde. En musstam av αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fastställdes genom att korsa Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (kallad Myh6-Cre nedan) med Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (kallad Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) möss nedan. Neonatal hjärt fibroblasts (NCFs) från P0-P2 neonatal möss isolerades och odlade in vitro, och en polycistronisk konstruktion av MGT introducerades till NCFs, vilket ledde till deras omprogrammering till iCMs. Eftersom endast framgångsrikt omprogrammerade iCMs kommer att uttrycka GCaMP3 reporter, kan funktionell mognad av iCMs visuellt bedömas av Ca2 + flöde med fluorescensmikroskopi. Jämfört med oprogrammerade NCFs visade NCF-iCMs betydande kalcium transienta flöde och spontan sammandragning, liknande CMs. Detta protokoll beskriver i detalj mus stam etablering, isolering och urval av neonatal möss hjärtan, NCF isolering, produktion av retrovirus för hjärt omprogrammering, iCM induktion, utvärdering av iCM Ca2 + flöde med hjälp av vår reporter linje och relaterade statistisk analys och data presentation. Det förväntas att de metoder som beskrivs här kommer att ge en värdefull plattform för att bedöma funktionell mognad av iCMs för hjärtomprogrammering studier.
Hjärtinfarkt (MI) är en allvarlig sjukdom över hela världen. Hjärt- och kärlsjukdomar är den främsta dödsorsaken i världen och står för cirka 18,6 miljoner dödsfall 20191,2. Den totala dödligheten i cvds har minskat under det senaste halvseklet. Denna trend har dock bromsats eller till och med vänts i vissa outvecklade länder1, vilket kräver effektivare behandlingar av cvds. Som en av de dödliga manifestationerna av CVD står MI för ungefär hälften av alla dödsfall som tillskrivs CVDs i USA2. Under ischemin, med blockering av kranskärlen och begränsad tillgång på både näringsämnen och syre, lider myokardiet allvarliga metaboliska förändringar, försämrar den systoliska funktionen hos kardiomyocyter (CMs) och leder till CM-död3. Många metoder i kardiovaskulär forskning har undersökts för att reparera hjärtskada och återställa funktionen hos det skadade hjärtat4. Direkt hjärt omprogrammering har dykt upp som en lovande strategi för att reparera det skadade hjärtat och återställa dess funktion5,6. Genom att introducera Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) kan fibroblaster omprogrammeras till iCMs in vitro och in vivo, och dessa iCMs kan minska ärrområdet och förbättra hjärtfunktionen7,8.
Även om hjärt omprogrammering är en lovande strategi för MI behandling, det finns fortfarande ett antal utmaningar. För det första är omprogrammeringseffektiviteten, renheten och kvaliteten inte alltid så hög som förväntat. MGT-incitament kan endast uppnå 8,4% (cTnT+) eller 24,7% (αMHC-GFP+) av de totala CFs som ska omprogrammeras till iCMs in vitro7, eller upp till 35% in vivo8, vilket begränsar dess tillämpning. Även med fler faktorer som induceras i systemet, såsom Hand29 eller Akt1/PKB10, är omprogrammeringseffektiviteten fortfarande knappt tillfredsställande att använda i en klinisk miljö. Det behövs därför fler studier som är inriktade på att förbättra omprogrammeringseffektiviteten på detta område. För det andra är iCMs elektriska integritet och sammandragningsegenskaper viktiga för en effektiv förbättring av hjärtfunktionen, men dessa är utmanande att utvärdera. För närvarande är allmänt använda utvärderingsmetoder inom området, inklusive flödescytometri, immunocytokemi och qPCR av vissa viktiga CMs gener uttryck, alla fokuserade på likheten mellan iCMs och CMs, men inte direkt relaterade till funktionella egenskaper hos iCMs. Dessutom har dessa metoder relativt komplicerade förfaranden och är tidskrävande. Medan omprogrammeringsstudier vanligtvis innebär en screening av potentiella omprogrammeringsfaktorer som främjar iCMs mognad11, kräver hjärtomprogrammering en snabb och bekväm metod baserad på iCMs-funktionen.
CMs öppnar de spänningshägnade kalciumjonkanalerna på cytomembranen under varje kontrakteringscykel, vilket leder till en övergående tillströmning av kalciumjon (Ca2+) från den intercellulära vätskan till cytoplasman för att delta i myofilamentkontraktionen. En sådan Ca2 + tillströmning och utflödescykel är det grundläggande draget för hjärtinfarkt och utgör den normala funktionen hos CMs12. Således kan en metod som upptäcker Ca2 + tillströmning vara ett potentiellt sätt att mäta funktionen hos CMs och CM-liknande celler, inklusive iCMs. För iCMs ger en sådan metod dessutom ett annat sätt att utvärdera omprogrammeringseffektiviteten.
Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECIs) har utvecklats och använts i stor utsträckning för att indikera cellaktiviteter, särskilt åtgärdspotentialer. I allmänhet består GECIs av en Ca2 + bindningsdomän som calmodulin, och en fluorescerande domän som GFP, och GCaMP3 är en med hög affinitet och fluorescensintensitet. Fluorescensområdet för GCaMP3 aktiveras när den lokala kalciumkoncentrationen ändras13. I detta dokument beskrivs en musstam som specifikt uttrycker en GCaMP3-reporter i Myh6 + celler. Genom att införa MGT till de isolerade NCF från nyfödda av denna stam kan omprogrammeringar övervakas av fluorescens, som framgångsrikt omprogrammerade iCMs kommer att ställa ut. En sådan musstam och metod kommer att ge en värdefull plattform för att undersöka hjärt omprogrammering.
Utvärdering av iCMs-funktionen är nödvändig för omprogrammeringsfältet för hjärt. I detta manuskript beskriver protokollet en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J musstam som har fastställts, hur man använder ncf isolerat från neonatal möss i denna stam för omprogrammering till iCMs och utvärderingen av iCMs funktion av Ca2 + flöde. Detta är en de novo-metod för att utvärdera iCMs funktionella mognad.
Flera kritiska steg är vi…
The authors have nothing to disclose.
Vi uppskattar Leo Gnatovskiys ansträngningar att redigera den engelska texten i detta manuskript. Figur 1 skapades med BioRender.com. Denna studie stöddes av National Institutes of Health (NIH) i USA (1R01HL109054) bidrag till Dr. Wang.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |