Aqui, descrevemos um protocolo para ajuste fino de regiões de interesse (ROIs) para tecnologias de Ômica Espacial para melhor caracterizar o microambiente tumoral e identificar populações celulares específicas. Para ensaios proteômicos, protocolos personalizados automatizados podem orientar a seleção de ROI, enquanto os ensaios transcriptômicos podem ser ajustados utilizando ROIs tão pequenos quanto 50 μm.
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Artigo de método
Perfil espacial da expressão de proteínas e RNA em tecidos: uma abordagem para ajustar a microdissecção virtual
Neste artigo
Resumo
Resumo
A multiplexação permite a avaliação de vários marcadores no mesmo tecido, proporcionando contexto espacial. As tecnologias Spatial Omics permitem a multiplexação de proteínas e RNA, alavancando anticorpos e sondas oligo-marcados foto-cliváveis, respectivamente. Os oligos são clivados e quantificados a partir de regiões específicas em todo o tecido para elucidar a biologia subjacente. Aqui, o estudo demonstra que protocolos automatizados de visualização de anticorpos personalizados podem ser utilizados para orientar a seleção de ROI em conjunto com ensaios de proteômica espacial. Este método específico não mostrou desempenho aceitável com ensaios de transcriptômica espacial. O protocolo descreve o desenvolvimento de um ensaio de imunofluorescência (FI) de 3 plexos para visualização de marcadores em uma plataforma automatizada, usando amplificação de sinal de tiramida (TSA) para amplificar o sinal fluorescente de um determinado alvo de proteína e aumentar o pool de anticorpos para escolher. O protocolo de visualização foi automatizado usando um ensaio de 3 plexos completamente validado para garantir a qualidade e a reprodutibilidade. Além disso, a troca de DAPI por corantes SYTO foi avaliada para permitir a obtenção de imagens de ensaios de FI baseados em TSA na plataforma de perfil espacial. Além disso, testamos a capacidade de selecionar pequenas ROIs usando o ensaio de transcriptômica espacial para permitir a investigação de áreas de interesse altamente específicas (por exemplo, áreas enriquecidas para um determinado tipo de célula). Foram coletadas ROIs de 50 μm e 300 μm de diâmetro, o que corresponde a aproximadamente 15 células e 100 células, respectivamente. As amostras foram transformadas em bibliotecas e sequenciadas para investigar a capacidade de detectar sinais de pequenas ROIs e regiões específicas do perfil do tecido. Determinamos que as tecnologias de proteômica espacial se beneficiam altamente de protocolos automatizados e padronizados para orientar a seleção de ROI. Embora esse protocolo de visualização automatizada não fosse compatível com ensaios de transcriptômica espacial, pudemos testar e confirmar que populações celulares específicas podem ser detectadas com sucesso mesmo em pequenas ROIs com o protocolo de visualização manual padrão.
Introdução
Os avanços nas técnicas de multiplexação continuam a fornecer melhores ferramentas de caracterização para alvos presentes em tumores. O microambiente tumoral (EMT) é um sistema complexo de células tumorais, infiltrando células imunes e estroma, onde a informação espacial é fundamental para melhor compreender e interpretar os mecanismos de interação entre biomarcadores de interesse1. Com técnicas emergentes, como o GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) e o 10x Visium, vários alvos podem ser detectados e quantificados simultaneamente dentro de seu contexto espacial. O uso de protocolos de imunofluorescência que facilitam a visualização tecidual po....
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Protocolo
Todos os tecidos humanos foram adquiridos de biobancos comerciais ou bancos de tecidos credenciados sob a garantia de que a aprovação apropriada do Conselho de Revisão Institucional e o consentimento informado foram obtidos.
Observação : O protocolo é executado usando o Discovery Ultra e o GeoMx Digital Spatial Profiler. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre reagentes, equipamentos e software usados neste protocolo.
1. Protocolo de visualização automatizada para ensaios de proteômica espacial
- Programa de autocoloração para aplicação de anticorpos de v....
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Resultados
Protocolo de visualização automatizada para orientar a seleção de ROI
Neste artigo, apresentamos o uso de um protocolo IF automatizado e personalizado baseado em TSA para visualizar o tecido e selecionar ROIs específicas. O desenvolvimento do painel de visualização usando melanoma e pele humana normal como tecidos de controle consistiu em testes de estabilidade de epítopos, ajuste fino das intensidades dos marcadores e avaliação de sangramento através de controles de deixar um de fora. Para testar se .......
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Discussão
Até o momento, anticorpos fluorescentes diretamente conjugados em um protocolo manual são mais comumente utilizados como painéis de visualização para ensaios de proteômica espacial ou transcriptômica espacial 9,10. No entanto, o uso de anticorpos fluorescentes diretamente conjugados pode ser um desafio para marcadores menos abundantes, limitando a seleção de anticorpos adequados. Este protocolo mostra que a marcação de marcadores de visualização pode ser automati.......
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Divulgações
Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan e Sandra Rost são funcionárias e acionistas da Genentech, membro do Grupo Roche. Outras empresas que fazem parte da Roche produzem reagentes e instrumentos utilizados neste manuscrito. Ciara Martin é funcionária em tempo integral da NanoString Technologies Inc, que produz reagentes e instrumentos usados neste manuscrito.
Agradecimentos
Os autores reconhecem Thomas Wu por processar arquivos NGS. Agradecemos a James Ziai pelas discussões dos resultados e revisão do manuscrito e Meredith Triplet e Rachel Taylor pela revisão interna do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10x Tris tampão salino (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluído para 1x TBS em água tratada com DEPC |
| Anticorpo X (não divulgado) | anticorpo cego devido à confidencialidade | ||
| Água tratada com DEPC | ThermoFisher | AM9922 | Outro pode ser usado |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referido como Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referido como FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referido como Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referido como OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referido como OMap anti-Rb |
| HRP DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referido como Rodamina 6G |
| DISCOVERY ULTRA Sistema Automatizado de Preparação de Lâminas | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referido como corador automático no manuscrito |
| FAP [EPR20021] Anticorpo | Abcam Ab207178 | ||
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referido como plataforma de perfil espacial no manuscrito |
| Câmara de umidade | Simport | M920-2 | Outro pode ser usado |
| Pan-citoqueratina [AE1/AE3] Anticorpo | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Análise estatística | |
| Tampão de reação (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Software de análise estatística | GraphPad | Prism 7 | Análise estatística |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Anticorpo Diluente com Caseína | Ventana | 760-219 | Referido como diluente especificado no manuscrito |
| Ventana Dispensador primário de anticorpos | Ventana | O número de catálogo depende do número do dispensador |
Referências
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572(2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J.
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Reimpressões e permissões
