Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) till funktionella hepatocytliknande celler (HLCs) genom att kontinuerligt komplettera Activin A och CHIR99021 under hESC-differentiering till slutgiltig endokderm (DE).
De potentiella funktionerna hos hepatocytliknande celler (HLC) som härrör från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) håller stora löften om sjukdomsmodellering och läkemedelsscreeningsapplikationer. Här tillhandahålls en effektiv och reproducerbar metod för differentiering av hESC:er till funktionella HLC:er. Upprättandet av en endoderm-härstamning är ett viktigt steg i differentieringen till HLCs. Med vår metod reglerar vi de viktigaste signalvägarna genom att kontinuerligt komplettera Activin A och CHIR99021 under hESC differentiering till slutgiltig endokderm (DE), följt av generering av lever stamceller, och slutligen HLCs med typiska hepatocyt morfologi i ett stegvis metod med helt definierade reagenser. HESC-härledda HLC som produceras med denna metod uttrycker scenspecifika markörer (inklusive albumin, HNF4α nukleär receptor och natriumtaurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), och visa särskilda egenskaper relaterade till mogna och funktionella hepatocyter (inklusive indocyanin grön färgning, glykogen lagring, hematoxylin-eosin färgning och CYP3 verksamhet), och kan ge en plattform för utveckling av HLC-baserade tillämpningar i studien av leversjukdomar.
Levern är ett mycket metaboliskt organ som spelar flera roller, inklusive deoxidation, lagring av glykogen och utsöndring och syntes avproteiner 1. Olika patogener, droger och äreditet kan orsaka patologiska förändringar i levern och påverka dess funktioner2,3. Hepatocyter, som leverns huvudsakliga funktionella enhet, spelar en viktig roll i artificiella leverstödsystem och läkemedelstoxicitet eliminering. Resursen för primära mänskliga hepatocyter är dock begränsad i cellbaserad terapi, liksom i leversjukdomsforskning. Därför är utveckling av nya källor till funktionella mänskliga hepatocyter en viktig forskningsriktning inom regenerativ medicin. Sedan 1998 när hESCs har etablerats4, hESCs har allmänt övervägts av forskare på grund av deras överlägsna differentiering potential (de kan differentiera i olika vävnader i en lämplig miljö) och hög grad av självförnyelse, och därmed ge idealiska källceller för bioartificial lever, hepatocyt transplantation och även levervävnadsteknik5.
För närvarande kan leverdifferenseffektiviteten ökas kraftigt genom att berika endodermen6. I härstamning differentiering av stamceller till endoderm, nivåer av den transformerande tillväxtfaktorn β (TGF-β) signalering och WNT signalering vägar är de viktigaste faktorerna i noden i endoderm bildandet steg. Aktivering av en hög nivå av TGF-β och WNT signalering kan främja utvecklingen av endoderm7,8. Activin A är en cytokin som tillhör TGF-β superfamilj. Därför används Activin A ofta vid induktion av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och hESCs9,10. GSK3 är ett serin-treoninproteinkinas. Forskare har funnit att CHIR99021, en specifik hämmare av GSK3β, kan stimulera typiska WNT-signaler och kan främja stamcellsdifferimering under vissa förhållanden, vilket tyder på att CHIR99021 har potential att inducera stamcells differentiering till endoderm 11,12,13.
Här rapporterar vi en effektiv och reproducerbar metod för att effektivt inducera differentiering av hESCs till funktionella HLCs. Den sekventiella tillsatsen av Activin A och CHIR99021 producerade cirka 89,7±0,8% SOX17 (DE-markör)-positiva celler. Efter att ha mognat in vitrouttryckte dessa celler leverspecifika markörer och utövade hepatocytliknande morfologi (baserat på hematoxylin-eosinfärgning (H & E)) och funktioner, såsom upptag av indocyaningrön (ICG), glykogenlagring och CYP3-aktivitet. Resultaten visar att hESCs framgångsrikt kan differentieras till mogna funktionella HLCs med denna metod och kan ge en grund för leversjukdomsrelaterad forskning och in vitro-läkemedelsscreening.
Här presenterar vi en stegvis metod som inducerar HLCs från hESCs i tre steg. I det första steget användes Activin A och CHIR99021 för att differentiera hESC till DE. I den andra etappen användes KO-DMEM och DMSO för att differentiera DE till lever stamceller. I den tredje etappen användes HZM plus HGF, OSM och hydrocortisone 21-hemisuccinate natrium salt för att fortsätta att differentiera lever stamceller i HLCs.
Följande kritiska steg måste beaktas när protokollet används. Cel…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81870432 och 81570567 till X.L.Z.), (nr 81571994 till P.N.S.); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr 2020A1515010054 till P.N.S.), Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 till P.N.S.). Vi vill tacka professor Stanley Lin från Shantou University Medical College för användbar rådgivning.
2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |